基于核酸适配体传感器检测食品致病菌的研究进展

王琦 颜春蕾 高洪伟 吴薇 杨庆利

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109；2.青岛农业大学机电工程学院，青岛 266109）

食源性致病菌，如沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌和弧菌等，是通过食品为媒介引起食物中毒的致病性细菌。常见的感染并发症，包括急性肠胃炎、腹泻、头痛、呕吐，甚至死亡。全球食源性病原体感染呈上升态势［1-2］，世界卫生组织表示，每年全世界有数十亿例由食源性致病菌引发的食物中毒事件。美国每年有4 800万人因食源性疾病而患病，导致12.8万人住院，3 000人死亡，损失156亿美元［3］。在美国和加拿大，由大肠杆菌O157：H7污染绿叶蔬菜引发的食源性疾病时常发生，这对种植者，生产者和公众安全产生了巨大的威胁［4］。在中国，对食品安全威胁最大的也是由食源性病原体污染造成的。2014年，中国31个监测地区共上报食源性疾病暴发事件1 480起，累计发病17 651人，死亡111人［5］。估算结果表明，食源性致病菌污染给公共卫生带来了沉重的负担，给地方政府带来了沉重的财政负担。因此，准确、早期诊断食源性致病菌有助于控制和预防感染的传播；此外，对食源性致病菌进行有效的鉴定至关重要。

近年来，以核酸为基础的检测方法被广泛用于检测食源性致病菌［6-7］。这些分析可分为两大类：核酸作为检测标志物和扩增模板，核酸作为检测探针。前一类方法与基于培养的方法相比，PCR是一种快速、灵敏、特异的检测各种病原体的标准方法［8］。PCR方法存在一个局限性：不能区分活的病原体和死的病原体，因为活的和死的病原体细胞都可以释放DNA。此外，在食品样品中应用PCR技术还存在一定的困难，因为很多食品样本中的PCR抑制剂会造成假阳性或阴性结果。对于后一类，外源性适配体是病原体常用的探针［9-10］。出于诊断目的，适体是抗体的合适替代品［11］。

适配体是（25-90 nt）单链核酸分子（DNA或RNA）通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）产生，SELEX是一种体外选择技术。作为生物识别元件，适配体能识别各种高特异性的靶标，包括离子、药物、真菌毒素、病原体或整个细胞［12-13］。适配体对特定靶标具有良好的亲和力，其解离系数（Kd值）范围在pmol/L到mmol/L之间。与抗体相比，适配体对温度、pH和离子强度等具有更高的稳定性，更容易合成和修饰，生命周期更长，成本更低。基于适配体的优势，适配体在构建基于适配体的检测和传感器方面受到了广泛关注，分别称为适配体检测和适配体传感器［14-15］。到目前为止，已经建立了不同的适配体传感器用于检测食源性致病菌，包括大肠杆菌［16］、金黄色葡萄球菌［17］、沙门氏菌［18］、副溶血性弧菌［19］、弯曲杆菌［20］、李斯特菌属［21］、志贺氏杆菌属［22］。适配体传感器简单快速，不需要繁琐的清洗和浓缩步骤。在这篇综述中，我们着重介绍了用于食源性致病菌的适配体传感器的最新进展。我们还评估了报道的适配体传感器的优越性和局限性，以确定一个合理的设计食源性病原体适配体传感器。

1 食品病原适配体筛选技术

从核酸的DNA或RNA随机文库中通过体外选择获得适配体。SELEX被用来选择识别各种目标的适配体，包括小分子、蛋白质、细菌和病毒、细胞系甚至整个细胞。Cell-SELEX是指以活细胞（细菌、病毒和细胞）为靶点进行适配体筛选的体外方法。相比于其他SELEX，Cell-SELEX的优势在于：（1）Cell-SELEX产生适配体探针可能有助于准确的检测和疾病诊断，因为它使用细胞表面的分子作为靶标；（2）与其他蛋白或分子SELEX不同的是，Cell-SELEX方法不需要提前知道生物标志物，而高纯度的重组蛋白或分子是选择适配体所必需的。通常，一个成功的适配体Cell-SELEX发现新的未知生物分子，并将其划分为潜在的生物标志物；（3）在Cell-SELEX中，靶分子均为天然构象，降低了处理靶分子构象的复杂性。此外，不需要将细胞固定在固体载体上。

另一方面，在Cell-SELEX中仍然存在某些技术挑战。（1）针对细胞表面低表达蛋白的适配体不易筛选；（2）所用细胞应能存活，生长正常，减少非特异性结合；（3）与其他SELEX相比，Cell-SELEX需要进行多轮的筛选才能获得高选择性和亲和的适配体，这需要花费更多的金钱和时间。幸运的是，我们已经做了大量工作来应对这些挑战。

通常，文库中的寡核苷酸包含一个20-60 nt的随机区，两侧各有两个20 nt的恒定区，用于引物结合和PCR扩增。与单链DNA文库不同，T7 RNA聚合酶的启动子序列被引入单链DNA文库的50末端区域，以生成RNA文库［23］。筛选技术分为两类：SELEX和Non-SELEX。

1.1 SELEX法筛选食源性病原体适配体

SELEX过程是筛选适配体通用的过程，包含5个主要步骤的重复（结合、分割、洗脱、扩增和调整）。SELEX的方案如图1所示。首先，合成一个随机DNA文库。核酸文库的序列由中间的随机序列和两端作为引物结合位点的固定序列组成。随机区通常为20-40 nt，其中包含的序列库容量为1013到1015。第二，在合适的条件下将核酸跟特定的靶标病原体一起孵育。第三，将弱结合和未结合的核酸从特异性结合到靶上的核酸中分离出来，用PCR或实时荧光定量PCR（Real time-PCR，RT-PCR）的方法从靶上洗脱并作为模板进行扩增。分离是筛选适配体最关键的步骤之一，它严重影响所选择适配体的结合常数。整个SELEX过程需要多次重复，以获得对目标具有最高亲和力和特异性的核酸。所需轮数取决于许多因素，如靶标特征和浓度、启动随机寡核苷酸库的设计、筛选条件或分离方法的效率。最后一轮SELEX在扩增步骤结束后被终止，PCR产物被克隆以获得单个的适配体克隆，这些克隆随后被测序［24］。对于RNA适配体的SELEX，RNA的 SELEX步骤还包括一个附加步骤即该结合RNA应作为随后的PCR扩增反向转录到cDNA［25］。

图1 利用SELEX筛选食源性致病菌适配体的示意图

除了筛选过程外，对靶标具有较高亲和力的序列也逐渐丰富了文库。经过5-15轮SELEX，可以获得适配体。最后，对文库进行克隆和测序，确定每个适配体的序列。适配体的结构分析可用于评价适配体对靶标的亲和性。为了筛选病原体适配体，常采用全细胞SELEX、磁珠SELEX和亲和层析SELEX［26-27］。在全细胞SELEX中，整个细菌细胞被用作靶细胞，以扩大筛选范围并避免靶细胞富集［28］。在磁珠SELEX中，复合材料的球体表面有利于最大化靶标暴露和易于分离。亲和层析SELEX的优点是成本低，重复性好，易于测定结合位点［29］。

1.2 Non-SELEX法筛选食源性病原体适配体

SELEX的筛选方法需要进行多轮的扩增和分离，这是一个非常耗时的过程。因此，如何快速获得理想的适配体成为关键技术。Non-SELEX是2006年Berezovski等［30］首次报道的毛细管电泳的一种变体，在随后的每一轮中都不需要PCR扩增和链分离。非平衡混合毛细管电泳一种典型的Non-SELEX方法，是一种高效的分离方法。Non-SELEX首先用于h-RAS适配体的筛选。与SELEX不同，Non-SELEX是一种更有效的筛选方法，不需要PCR步骤。经过2-3轮的分离和筛选，可以获得靶标的特异性适配体。Maeng等［31］报道了用非平衡毛细管电泳法经过3轮Non-SELEX筛选出大肠杆菌O55：B5脂多糖的适配体。一般SELEX包括8-15轮筛选耗时1-3个月。然而，Non-SELEX只需要数小时到数天的适体筛选，这比SELEX过程更短，更容易。而Non-SELEX的局限性是毛细管电泳仅适用于大分子物质。

适体的Non-SELEX有3个主要特征。（1）Non-SELEX快速而简单：Non-SELEX筛选耗时仅为1 h，可以使用商用毛细电泳仪器以自动化方式执行；（2）可以准确地确定一个DNA文库中的适配体；（3）Non-SELEX最显著的优点是它适用于非扩增DNA文库，如通过DNA合成获得标签修饰DNA。标签可以与磁珠或其他功能纳米粒子结合，从而获得新的Non-SELEX策略。这些特性使Non-SELEX成为药物发现中潜在的不可或缺的工具。

无论是SELEX还是Non-SELEX，都没有针对任何靶标的标准化选择模式。适配体的选择过程经过多年的改进，变得更高效、更省时，达到更高的特异性和亲和度。表1总结了经不同SELEX方式筛选得到的食源性病原体（大肠杆菌，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等）的适配体。这些适配体可直接用于建立适配体传感器，从而快速、灵敏、特异地检测食源性病原体。

2 食源性致病菌的适配体传感器

病原体检测是食品安全和公众健康的关键。食源性致病菌的3个主要应用领域是食品工业、环境质量控制和临床诊断。近几年在检测病原体相关的基础研究、方法性能研究和新应用方法的开发方面做出了巨大的贡献［51-52］。

表1 不同筛选方法得到的食源性致病菌的适配体

迄今为止，适配体传感器很少应用于食品安全和公共卫生［53］。其核心原因可能是适配体传感器和样品提取、纯化、富集和分离过程过于复杂。食源性致病菌检测是影响公众健康和食品安全的重要因素。接下来的工作应转到基础研究、方法性能研究和发展新的应用方法上［54］。与传统的免疫传感器相比，适配体传感器在识别生物传感器方面具有许多优势：适配体体积小，化学稳定性好，性价比高。基于这些特性，许多基于适配体的生物传感器被用于检测食源性病原体［55-56］。适配体传感器通常根据转换平台（比色、光学、荧光、电化学、表面增强拉曼、试纸条传感器）进行分类的。表2比较了已报道的用于食源性致病菌检测的适配体传感器的优缺点、LOD值和检测范围。此外，我们对已报道的用于食源性病原菌检测的适配体生物传感器进行了综述和分类（图2）。

表2 用于食源性致病菌检测的传感器的性能比较

图2 病原体检测常用传感器示意图

2.1 比色适配体传感器

比色传感器是将目标信号转化为颜色变化的过程，由于其可以直观读出结果、方便、操作简单等优点而受到广泛关注［64］。比色法的关键技术是显色底物和催化酶的选择。辣根过氧化物酶和G-四联体都具有DNA催化酶的特点，可以催化底物产生比色信号。以G-四联体和辣根过氧化物酶为信号放大器的适配体，因为简单、稳定性好、价格低廉等优点，已被应用于多种靶标的检测［65］。Sun等［57］基于G-四联体构建了一种用于副溶血性弧菌检测的比色传感器。首先将适配体及其互补序列固定在磁珠上。当出现副溶血弧菌时，适配体优先与副溶血弧菌结合，互补链游离出来，与氯高铁血红素结合形成G-四联体，加入的靶标越多，上清液就有越多的G-四联体。添加的TMB和过氧化氢可以被G -四联体催化产生蓝色，达到检测目的。

但是过氧化物酶存在保存困难、易受外界条件影响、催化活性不稳定的缺点，而过氧化物酶的替代物将克服这一局限性。2013年，Woo［66］发现Fe3O4纳米粒子具有辣根过氧化物酶活性，由于其具有大的表面积和可控的催化活性而得到了广泛的应用。目前，已经合成了多种金属氧化物纳米粒子作为过氧化物酶模拟物，如CeO2纳米粒子、Co3O4纳米粒子和ZnFe2O4纳米粒子［67-69］。Wu等［58］开发了一种新型的用ZnFe2O4还原氧化石墨烯（ZnFe2O4/rGO）纳米颗粒作催化剂的比色适配体传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌（图3）。将生物素修饰的适配体1固定在微板上作为捕获探针，ZnFe2O4/rGO结合适配体2作为信号探针。在溶液中有鼠伤寒沙门氏菌时，就会形成适配体1-靶标-适配体2-ZnFe2O4/rGO的“夹心”复合物，而ZnFe2O4/rGO可以催化H2O2氧化3，3'，5，5' -四甲基联苯胺（TMB），生成蓝色产物，可以在652 nm处用微阅读器进行检测。缓冲液中鼠伤寒沙门菌的检出限为11 CFU/mL，检测范围为11-1.10×105CFU/mL。

图3 基于ZnFe2O4还原氧化石墨烯材料的比色传感器用于鼠伤寒沙门氏菌检测的原理图（改编于［58］）

此外，另一种无标签传感器是金纳米粒子［70-72］。它不需要复杂的准备程序或精密的仪器，并提供肉眼可见的读数；在某些情况下，胶体金会由红色变为紫色。核酸适配体容易吸附在金纳米粒子表面，保护金纳米粒子免受离子诱导的聚集。相反，适配体与金纳米粒子表面解离，在目标病原体存在时与目标物结合，导致颜色从红色变为紫色。

2.2 可见光适配体传感器

利用机械、电子、核磁共振和光学检测方法，已经制造出各种用于病原体检测的生物传感器［73-75］。等离子体生物传感器是一种可见光生物传感器，具有较高的灵敏度和重复利用的能力［76］。Yang等［59］构建了一种非共价自组装检测伤寒沙门菌的方法，利用DNA酶标适配体检测探针自组装单壁碳纳米管。在该方法中，选择一个DNAzyme序列（P1）和适配体Apt22（P2），并将其设计为检测探针P0与单壁碳纳米管自组装，形成稳定的复合体。加入靶细菌和血红素后，它们将与探针特异性结合，导致P0脱离碳纳米管，并形成血红素/G-四联体。该自组装的DNA酶充当化学发光产生的催化剂。通过H2O2氧化鲁米诺而导致检测信号的放大。该方法的检出限为103CFU/mL（图4）。Urmann等［60］提出了一种简单、无标签且快速的光学生物传感器，能够特异性检测蛋白A，金黄色葡萄球菌的特异性生物标记物。将蛋白A的适配体固定在纳米结构的多孔硅薄膜上，作为光学传感器元件。金黄色葡萄球菌的适体传感器的线性检测范围为8-23 μmol/L，LOD为3.17 μmol/L。此外，使用了夹心法改进的光学信号放大方法。使用这种方法，LOD提高了3倍。

图4 基于等离子体的适配体传感器用于伤寒沙门菌检测的原理图（改编于［59］）

2.3 荧光适配体传感器

当价电子从基态被激发到激发的单线态时，就会产生荧光。激发是由吸收足够能量的光产生的［61］。荧光光谱法是一种对低浓度物进行灵敏检测的可靠方法。荧光染料分子和荧光纳米材料是两种主要的荧光信号源［77-78］。

对于前一种方法，适配体传感器通常是在分子水平上的感应或响应步骤上集成的荧光分子，采用均相溶液进行感应。也就是用FITC、Cy3、Cy5等荧光基团对特异性适配体进行化学修饰，记录其荧光强度。Zhu等［61］利用氧化石墨烯对单链DNA吸附能力以及荧光猝灭能力，构建了一个信息隐写适配体荧光平台，用于鱼病原菌的活体成像中对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌的共同检测。在该传感器中，这些元件可以通过所附的荧光适配体或游离的适配体进行编码或解码，其中氧化石墨烯作为锁，目标病原体作为公钥，适配体结合病原体作为加密密钥。对分子水平上多功能备件或机器的发展具有指导意义。

荧光多功能纳米颗粒已经被合成并成功地用于蛋白质、病毒、细胞和病原体的分析。Wang等［79］使用了标记有多色掺杂镧系元素的时间分辨荧光纳米粒子用于检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌（图5）。在该方法中，将适配体作为信号探针修饰在合成的掺杂镧系元素的无机纳米粒子上。Gd3+和Ce3+用作敏化剂，以增强Eu3+和Tb3+的发射荧光强度。此外，固定有适配体的Fe3O4磁纳米粒子被用作捕获探针。该方法比常规的生物检测法具有更高的灵敏度。具有高通量，高灵敏度，快速的优点，最低检测限分别为15和20 CFU/mL。

图5 用于食源性致病菌检测的不同荧光传感器（改编于［79］）

2.4 电化学适配体传感器

电化学生物传感器在各种类型的生物传感器中具有其独特的优势，即便宜且易于操作［80］。Abbaspour等［62］报道了一种基于电化学双适配体的阳极溶出伏安法用于夹心检测金黄色葡萄球菌（图6）。通过生物素-链霉亲和素亲和反应将生物素化的抗金黄色葡萄球菌适配体固定在链霉亲和素包被的磁珠上，加入靶标之后，适配体捕获金黄色葡萄球菌。随后加入修饰有第二抗金黄色葡萄球菌适配体的金纳米粒子（AgNPs），适配体特异性识别靶标形成三明治夹心结构，从而引入信号标签AgNPs。最后加入硝酸以还原金离子以金原子的形式溶出在电极表面，金黄色葡萄球菌浓度越大产生的差分脉冲溶出伏安信号越强。该传感器的最低检测线低至1 CFU/mL。

图6 用于食源性致病菌大肠杆菌检测的电子式传感器（改编于［62］）

无标签电化学检测是电化学生物传感器发展的一个绝佳的选择。特殊的纳米颗粒已经广泛应用于构建无标签传感器用于检测各种靶标。Wang等开发了一种新型电化学阻抗适配体传感器，用于快速、灵敏地检测O157：H7型大肠杆菌［56］。链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的O157：H7型大肠杆菌抗体先后被固定在充满高梯度磁场的毛细管上，随后加入的靶标被特异性捕获并固定在上面。将核酸适配体和脲酶修饰到金纳米粒子上，注射到毛细管中与靶标发生反应，形成MNPs-抗体-细菌-适配体-金纳米粒子-脲酶复合物。大肠杆菌的浓度越大，引入的脲酶越多，脲酶催化尿素水解反应从而降低了金电极的阻抗。而阻抗变化与靶浓度呈负相关。该传感器在最优条件下对大肠杆菌的最低检测线为10 CFU/mL。

2.5 表面增强拉曼散射适配体传感器

与光学、比色、荧光和电化学传感器相比，表面增强拉曼散射（SERS）设备不需要信号转导就可以直接获得分析物的SERS谱，从而将识别分子的分子谱指纹图谱与分析结合物区分开来［81］。这种独特的性能不仅有效地提高了样品对矩阵干扰的选择性，而且避免了在器件中使用传感标签，简化了设计，降低了成本。这些优点有助于SERS在环境污染物和食品安全监测的广泛应用。对于金黄色葡萄球菌，首先将样品孵育并通过适配体-细菌-银纳米粒子复合物固定在银纳米粒子上。银纳米粒子的诱导极大地增强了SERS信号，因为一个细菌结合了许多适配体和银纳米粒子。在735 cm-1处观察到SERS强度增加的信号，在10-107CFU/mL之间呈正相关，LOD低至1.5 CFU/mL。此外，很容易将金黄色葡萄球菌与病原体混合物区分开来，提高了其他类似分析的选择性［63］。对于鼠伤寒沙门氏菌，在725 cm-1处的增加信号与其他细菌有明显的区别［82］。

2.6 侧流适配体传感器

侧流试纸条（LFS）又称试纸测试条，是一种很有前景的现场检测方法。我们的团队之前开发了不同类型的LFS用于核酸、金属离子、病原体和干细胞的可视化检测［83-85］。这些生物传感器使用方便、灵敏、特异，并且不需要复杂昂贵的仪器。最重要的是，检测结果可以用肉眼观察到。试纸条适配体传感器（LFA）是结合适配体作为识别元件的LFS。Wu等构建了一个LFA，用于对常见海产品传播的副溶血性弧菌进行简单直观的检测［19］（图7）。该研究对两种特定的适配体进行了修饰，用于目标捕获和信号放大。当副溶血性弧菌存在时，形成了a-适配体/靶标/ c-适配体/磁珠复合体。然后以夹心复合物为模板进行等温扩增，将扩增后的单链加到LFS上。整个过程可以在55 min内完成；富集处理（20 min），等温扩增（30 min）和LFS测定（5 min）。在优化条件下，副溶血性弧菌的LOD在纯培养条件下计算低至5.6 CFU/mL。未观察到与其他弧菌和非弧菌的交叉反应。不需要提取DNA，简化的操作和结果可视化使该LFA适用于临床、食品和环境样品中副溶血性弧菌的快速检测。此外，这种类型的LFA也可以用于其他分析物。该研究成功地证明了LFA在食源性污染检测中的有效性和敏感性。

图7 用于食源性致病菌副溶血性弧菌检测的试纸条传感器（改编于［19］）

3 总结与展望

在过去的几十年里，用于检测不同分析物的各种适配体传感器在这一领域受到了越来越多的关注。本文综述了近年来应用于食源性致病菌监测和基于新型传感器信号产生的研究进展。

未来食源性致病菌检测面临的最大挑战是如何在日益严重的食源性污染和越来越严格的环境友好性分析方法之间找到平衡点。正如我们所知的，适配体传感器的化学分析是一个复杂的过程。绿色适配体传感器存在6个重要的问题，包含样本问题（最小样本量），试剂问题（安全无毒试剂），仪器问题（小型化和节能仪器），转换方法问题（自动化和现场信号读取），废弃物问题（合理处置废弃物）以及操作问题（人性化）。随着绿色分析化学的发展，食源性致病菌绿色传感器的研制将会越来越成功。此外，这些展望将是生物传感器领域的一个突破。

不可否认生物传感器在实际食源性致病菌检测中仍存在一定的局限性。（1）食品样品中通常含有多种干扰物质（蛋白质或糖类），可能会阻碍靶标与适配体之间的特异性相互作用。因此，物理吸附法捕获靶标的稳定性差，灵敏度低。为了解决这个问题，有必要对传感器表面进行修饰，以增强适配体与靶标捕获的固定性；（2）食品样品中某些病原体浓度过低，无法准确检测。解决这一问题将有利于今后在提高灵敏度和选择性以及提高样品处理量等方面进行创新。目前已有各种各样的方法被用于信号放大，使得灵敏度更高，检测限更低；（3）大部分报道的适配体传感器在体外检测食源性致病菌。因此，有必要在不进行预富集的情况下设计用于测定体内和复杂基质中靶标浓度的传感器。总的来说，虽然还有一些障碍需要克服，但适配体传感器在健康、环境和食品质量领域具有巨大的未来潜力。

未来的发展方向是将纳米技术结合到适配体传感器中。由于纳米技术具有良好的生物相容性、较高的比表面积和增强的电子传递性能等优点，因此在生物传感领域具有广阔的应用前景。结合了磁性纳米粒子的适配体可以增强对靶标的捕获活性，提高选择性。纳米电极或纳米材料可以显著提高传感器的灵敏度。应用最小电极或磁珠来制造单个传感装置，为适配体对靶标的响应提供了新的视角。此外，芯片上实验室纳米技术具有最小的样品负载、微电子机械传感和高通量，是病原体生物传感的一个理想的研究方向。