3种霉菌在油茶饼粕的固态发酵生长对比*

张 晖 王炳新 董 斌 黄永芳

（1.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学/广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；3.广东省台山市林业局，广东 台山 529000；4.广东农工商职业技术学院，广东 广州 510507）

目前油茶研究热点主要集中在良种选育、繁育和栽培、茶皂素、皂苷等方向[1]。据不完全计算，我国每年生产茶油、油茶籽粕产量约为150万吨。油茶饼粕中的茶皂素(占10%-14%)是一种五环三萜类皂苷，其基本结构由皂苷元、糖体、有机酸构成，同时也是一类良好的表面活性剂，同时还具备抗菌消炎、抗高血压、抗渗透和抑制酒精吸收等生物活性[2-4]。由于油茶饼粕中含有丰富的营养物质，可作饲用。但鉴于茶皂素的特殊性，不利于油茶饼粕直接用于饲用，因此，近年关于茶粕利用微生物以去除茶皂素的研究成为关注的方向[5-7]。朱培等[8]研究结果显示油茶饼粕中氨基酸的均衡性较差，不同加工工艺对油茶饼粕的营养成分有一定的影响，低温冷榨油茶粕是潜在的饲料原料。目前，油茶茶籽榨油方式还是以传统压榨为主。因此如何有效利用油茶饼粕，在油茶饼粕已有的研究上开展一个绿色生态环保的新方向成为当前需要解决的问题。油茶饼粕的固态发酵常规做法是通过自然发酵处理。本研究使用哈茨木霉Trichoderma harzianum、黑曲霉 Aspergillus niger、鲁氏毛霉Mucor roxianus 于不同环境温度和油茶饼粕含水量下进行固态发酵，对比3 种霉菌在已脱茶皂素和未脱茶皂素油茶饼粕中的生长状况，探讨有利于油茶饼粕固态发酵的条件控制，为油茶饼粕固态发酵作有机肥应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种及活化培养

本试验采用的菌种哈茨木霉(简称木霉)、黑曲霉、鲁氏毛霉(简称毛霉），为冻干菌种。菌种活化培养用培养基为综合马玲薯培养基，1 L 培养基中含20% Potato extract(马玲薯汁)，KH2PO43 g，Vitanib B1(硫胺素)Trace 8 mg，Glucose(葡萄糖) 20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH=6。

1.2 油茶饼粕去茶皂素处理

通过水提法脱去茶皂素的油茶饼粕。水提法是将油茶饼粕浸泡在pH=10，固液比1:10 的80℃热水中，12 h 后进行脱水，60℃烘干备用[9]。

1.3 菌体的选取

根据菌体在液体培养基中生长变化曲线，选择生物量处于最高稳定时期作为油茶饼粕发酵用的菌体材料。

1.4 油茶饼粕发酵设置

油茶饼粕（分未脱茶皂素与已脱茶皂素）分装到组培瓶中，每个组培瓶装30.0 g 材料，105℃下灭菌4 h（以不灭菌处理为对照）。灭菌后加入无菌水以调节油茶饼粕含水量（40%、50%、60%、70%），分别接入菌体2 g 于油茶饼粕中，将材料置于20、30、40℃的人工气候箱中，每个处理3 个重复。

试验分对照（不添加菌种）和添加菌种（毛霉、木霉和黑曲霉）处理，设置3 个温度区间20、30、40℃，以及含水量（40%、50%、60%、70%），试验进行完全组合。

在第30 天对各处理茶粕中的菌丝生长进行分级评价，无菌丝生长记“0”，茶粕表面生长记“1”，茶粕体上半部生长记“2”，茶粕体全部有菌丝生长记“3”，*代表处理中水与茶粕出现分层。

2 结果与分析

2.1 3 种霉菌在液体培养基中生长比较

图1 霉菌在液体培养基生长表现Fig.1 The growth of three fungi in liquid medium

由图1 可见，毛霉生长较快，培养12 h 时，毛霉生物重为47.6 g/L，而木霉与黑曲霉分别为9.6 和9.5 g/L。毛霉在16-24 h 间生物重平稳，随后生物重逐渐减少；而木霉生物重在36 h 达339.1 g/L，黑曲霉在44 h 时生物重达到最高，为327.4 g/L。油茶茶粕中毛霉、木霉和黑曲霉分别选取其在16、36 和44 h 时间段的菌体作为试验用的材料。

2.2 3 种霉菌在油茶饼粕中的生长对比

2.2.1 3 菌种接种于未脱茶皂素油茶饼粕中的生长 将3 种霉菌种接种于未脱茶皂素油茶饼粕中，在不同的温度和含水量条件下培养一段时间，菌种的生长如表1 所示。

在20 ℃，对照处理（含水量40%、50%、60%）菌丝在油茶饼粕表面生长，但未能布满油茶饼粕，在含水量70%条件下菌丝只能匍匐生长于表面，并且很快停止生长；在30℃下的菌丝生长优于20℃，在40℃时油茶饼粕出现明显分层，菌种生长表现不良。

毛霉在20℃时的生长明显优于对照组。在含水量50%时，其菌丝能遍布整个油茶饼粕。在30℃下，含水量40%、50%和60%的生长与对照组相似；但在40℃条件下，油茶饼粕上的菌丝到第5 天已经停止生长，并且此温度下油茶饼粕上层已经逐渐失水干化。

木霉在20℃和30℃下的生长相似，在第3 天时，菌丝开始生长，生长与毛霉相似。在第7 天，40℃处理组，除了含水量40%的油茶饼粕有少量菌丝外，其它处理中的木霉菌丝未见生长。

黑曲霉在20℃时菌丝生长优于30℃，特别是在20℃含水量50%时，菌丝能遍布整个油茶饼粕(图2)，与同处理的毛霉生长相似；在40℃各处理组的菌丝未见生长。

2.2.2 3 种霉菌在已脱茶皂素茶粕中的生长对比 在已脱茶皂素油茶饼粕中（表2），20℃时，对照处理(含水量40%、50%、60%)的菌丝出现时间滞后于其他3 个霉菌处理，但其生长优于含水量70%处理组。30℃时，含水量40%和50%处理组是试验中生长较好的，而含水量70%时其菌丝只在饼粕表面生长，并且生长的时间很短。40℃下的所有含水量处理仍未见菌丝出现。

毛霉的生长优于对照组，在20℃下，含水量50%和60%处理组的菌丝能大量生长，并且都能深入到油茶饼粕底部，而含水量40%（图3）和70%处理组的菌丝停留在茶粕上半部。在30℃，含水量40%、50%、60%处理组比70%的菌丝多，并且50%、60%处理组的菌丝已深入到油茶饼粕下层，而含水量70%处理组的菌丝生长仅限于油茶饼粕表面。30℃下菌丝的生长优于20 和40℃。

表1 3 种霉菌在未脱茶皂素油茶饼粕中的生长对比Table 1 The growth of three fungi in Camellia oil-tea cake

图2 3 种霉菌在未脱茶皂素油茶饼粕生长Fig.2 The growth of three fungi in Camellia oil-tea cake

表2 3 种霉菌在已脱茶皂素油茶饼粕中的生长对比Table 2 The growth of three fungi in non-saponin oil-tea cake(Camellia)

木霉在20 和30℃时，含水量40%、50%和60%处理组的菌丝生长量都比较多，并且能够长满整个油茶饼粕，而含水量70%处理组的菌丝只限于表面生长。木霉在40℃各处理中没有发生变化。

黑曲霉的生长与木霉相似，优于毛霉和对照组。在40℃下各处理组，黑曲霉在接种第3 天开始生长，到第9 天 时已经停止生长，并且茶粕也变成黑色。

2.3 单因素分析评价

从图4 不同菌种在未脱茶皂素油茶饼粕与已脱茶皂素油茶饼粕生长比较结果可见，黑曲霉在未脱茶皂素与已脱茶皂素油茶饼粕中的生长均优于毛霉与对照处理；并且已脱茶皂素油茶饼粕更有利于3 种霉菌在茶粕中生长。

图3 3 种霉菌在已脱茶皂素油茶饼粕生长Fig.3 The growth of three fungi in non-saponin oil-tea cake

图4 不同菌种处理生长比较Fig.4 The growth of different fungi in Camellia oil-tea cake and non-saponin oil-tea cake

2.3.1 不同温度处理生长比较 在未脱茶皂素油茶饼粕中(图5a)和已脱茶皂素油茶饼粕中（图5b），30℃时菌体的生长优于20 和40℃，而在已脱茶皂素油茶饼粕下菌体生长更好。

2.3.2 不同含水量处理生长比较 在未脱茶皂素油茶饼粕中(图6a)，含水量40%、50%、60%比70%有利于菌体的生长，40%时木霉生长最好，50%时黑曲霉生长最好，总体来说木霉、黑曲霉较毛霉、对照生长更好。在已脱茶皂素油茶饼粕中(图6b)，含水量40%、50%和60%对菌体的生长更有利，但是在70%时，则不利于菌体生长。

3 结论与讨论

茶皂素对微生物的抑制作用已有研究，黄卫文等[10]用溶剂法提取油茶枯饼中的皂素对大肠杆菌、桔青霉等6 种真菌进行了抑菌试验，其结果均表明具有抑制作用。在本研究中，3 种霉菌在同等的条件下，茶皂素对3 种霉菌以及对照的生长具有一定的抑制作用。在未脱茶皂素的油茶饼粕处理中，只有毛霉和黑曲霉在20℃和含水量50%时其菌丝能在茶粕中保持旺盛生长，其它处理只能在表面或上半部生长。对于菌种在未脱茶皂素与已脱茶皂素油茶饼粕的差别，与钟海雁等[11]研究相一致。

在已脱茶皂素的油茶饼粕中，除了含水量在70%处理组中3 种霉菌只见于油茶饼粕表面生长外，其他的含水量（40%、50%、60%）菌种都能很好的在饼粕中生长。这与3 种霉菌的对氧气需求性有关。

温度对固态发酵的影响不只于霉菌的生长温度。已有的油茶饼粕固态发酵研究表明，霉菌的最适生长温度在28-32℃左右[11]。温度的高低直接影响其生长活性。在已脱茶皂素和未脱茶皂素油茶饼粕中均显示，当温度为40℃时，已经不利于试验中3 种霉菌的生长，主要是水份的散失造成，使得材料在40℃下失水，进而限制菌丝生长。

一直以来，油茶的研究主要集中在食品与化学方面[12]，对油茶饼粕的固态发酵研究不多。油茶饼粕中茶皂素的存在是限制其直接固态发酵的因素之一，而茶皂素又是一个经济价值较高的日化原料。虽然茶皂素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌具有明显抑制作用[13]。但是如果将油茶饼粕与其他植物材料如豆粕一起混合后发酵，其抑制效果明显降低，并能进一步满足不同要求[14-16]。因此，建议油茶饼粕可先通过物理方法去除茶皂素，再作固态发酵。

图5 不同温度处理在油茶饼粕生长比较Fig.5 The growth in different temperatures of Camellia oil-tea cake

图6 不同含水量处理下油茶饼粕生长比较Fig.6 The growth in different water content of Camellia oil-tea cake