多灶肝细胞癌异质性的多组学研究与临床意义

匡 铭, 许丽霞, 刘 信, 章 颖, 沈顺利

中山大学附属第一医院 a.肝外科； b.肿瘤科； c.放射治疗科， 广州 510080

肝细胞癌(HCC)是一种原发于肝脏的恶性肿瘤，高居全球癌症死亡率的第四位[1]。我国每年新诊断的HCC患者约46.61万例，每年大概有42.21万例患者死于HCC，发病及死亡人数均接近世界的一半[2]。HCC的恶性程度高，复发率高，预后较差。据报道[3-5]，有50%～75%的HCC在诊断时已是多个病灶，治疗方式十分有限且效果不佳。

对于多灶HCC，剩余肝脏储备功能的不足极大增加了手术切除的难度，即使可以顺利手术，患者术后5年复发率仍高达70%～80%，极高的复发率导致患者预后不良[6]，预防复发是实现HCC患者长期生存的关键[7]。然而，在STORM研究[8]中，索拉非尼作为一线靶向药物，并没有降低根治性治疗后HCC患者的复发率。HCC高度的异质性被认为是治疗失败的主要原因[4,9]。此外，对于失去根治性治疗机会的晚期HCC患者，靶向治疗作为一线治疗方案，其中位无进展生存时间仅为3.6～7.3个月[10-11]，不良反应的发生率超过80%。越来越多的临床研究结果显示免疫治疗是晚期HCC很有前景的治疗手段。免疫检查点抑制剂，如细胞程序性死亡蛋白-1(programed cell death protein-1，PD-1)抗体治疗晚期HCC患者的一线治疗总体生存时间为28.6个月，二线治疗总体生存时间为12.9～15个月[12-14]。然而，PD-1抗体治疗HCC的总体响应率低于20%[13-14]。药物靶点和免疫微环境的异质性被认为是临床上靶向和免疫治疗疗效不一的主要原因[15]。

相比于单个病灶，多灶HCC的肿瘤异质性更为复杂[16-18]。HCC的多个病灶可能来源于多个中心或者是同一个原发灶的肝内转移[19]。近来多个研究从基因突变、拷贝数变异(copy number alterations，CNAs)、结构变异(structure variations，SVs)和HBV DNA的整合位点[20-24]的角度评估了多灶HCC的肿瘤起源和基因组异质性。此外，多灶HCC的转录异质性，尤其是免疫的异质性与免疫治疗反应有关[23-25]。

本文基于多灶HCC的基因组和转录异质性研究领域的文献报道，并结合作者的研究成果，重点介绍多灶HCC的肿瘤起源、基因组结构、克隆进化以及不同病灶间的RNA表达和肿瘤免疫微环境特征，并探讨上述异质性对多灶HCC精准诊疗的影响。

1 多灶HCC的基因组特征

1.1 多灶HCC的起源种类及基因组特征 多灶HCC可分为多中心起源HCC(multicentric occurrence HCC，MO-HCC)和肝内转移HCC(intrahepatic metastases HCC，IM-HCC)两种类型，临床预后差别巨大。MO-HCC的起源是一种多克隆的过程[26]，意味着各病灶从起源时就有着相互独立的克隆来源。这种类型的多灶HCC患者进行根治性手术治疗的效果较好，且即使术后复发，仍能从二次手术或局部治疗中获得较好的治疗效果。相比之下，IM-HCC则由相同克隆来源的肿瘤细胞发生肝内转移，此种类型肿瘤的生物学行为更具侵袭性，患者接受手术治疗后常早期即出现复发[27]，即使采取更为激进的治疗方式，预后仍然较差。因此，区分这两种不同来源的HCC对优化多灶HCC患者的预后判断具有重要意义。

传统方法如观察肿瘤的组织病理学形态[28-29]，检测p53等高频突变蛋白[30]等难以区分IM-HCC和MO-HCC。越来越多的研究[21,26,31-32]利用全基因组/外显子组和转录组测序来识别一些生物标志物，从而区分肿瘤的起源。采用基因组和转录组分析，Miao等[31]探究了两例多灶HCC患者肿瘤的克隆起源及其接受根治性手术治疗后预后的差异。患者1不同病灶间的基因突变模式、CNA谱、SV特征和HBV DNA整合位点十分相似，该患者的多发病灶被认为是IM-HCC，在根治性手术后3个月即死于复发。患者2的各个病灶之间具有明显的HBV DNA整合位点和基因组突变的差异，其多发病灶被认为具有独立的来源(MO-HCC)，且转录组功能分析结果显示，该患者没有发现任何一个在前一例患者中发现的与侵袭转移有关的分子特征。该患者术后2年仍然处于无瘤生存状态[31]。

越来越多的研究发现，同一多灶HCC患者不同病灶间，基因突变谱、CNAs、SVs和肿瘤克隆进化存在很明显的异质性。不同多灶HCC患者之间，所有病灶共有的基因突变比例差异较大。研究[4,32-33]表明，IM-HCC的共有基因突变比例在8%～97%，而MO-HCC不同病灶间几乎没有相同的基因突变。CNAs在多灶患者不同病灶间也存在较大的异质性。例如，在IM-HCC中，共有CNAs的比例为22.2%～100%，MO-HCC不同癌灶间共有的CNAs最高为46.7%[26]。作者采用全外显子组及全基因组测序技术，也证实了多灶HCC患者不同病灶间基因突变和CNAs存在较大的异质性[23]。HBV感染者在肝癌发生前，HBV DNA与宿主基因组的随机位点结合，使得这个位点结合信息对每一个肿瘤克隆都是特异的。因此，具有相同HBV DNA整合位点的病灶被认为是肝内转移灶[32]。包括作者研究在内的多项研究[24,26,34]显示，IM-HCC中HBV DNA整合的模式相同，而在MO-HCC中HBV DNA整合的模式不同，进一步证实了上述观点。此外，在不同病灶中基因组SVs的数目存在差异[21]，Miao等[31]在多灶HCC的不同灶中发现了13～26个数目不等的SVs。作者的研究结果则显示在同一患者中，较小病灶的SV数量与较大病灶相比，有增加的趋势[24]。

1.2 多灶HCC的克隆进化及其在精准靶向治疗中的意义 遗传起源与克隆进化分析进一步证实了多灶HCC的基因异质性。基于所有体细胞突变构建多灶HCC患者的遗传进化树发现，不同患者之间存在很大差异[23,26,31]。进一步将包括可靶向用药等主要的驱动突变映射到每个遗传进化树中，只有9%～85%的驱动基因改变位于树干[18]，这表明多灶肿瘤遵循肿瘤分支进化的模式[26,32]。作者的研究表明，只有30%(18/60)的驱动基因改变和20%(3/15)的药物靶点位于遗传进化树的树干，说明多灶HCC患者中不同病灶间存在着巨大异质性。值得注意的是，仅1/6患者的进化树树干中发现了索拉非尼靶基因的改变(如BRAF扩增、PDGFRB扩增和VEGFA扩增等)，这可能是临床中索拉非尼治疗反应率相对较低的原因[23]。笔者的研究表明，药物靶点的异质性有助于解释多灶HCC患者对靶向药物治疗反应不一的临床现象。

研究驱动基因突变的克隆状态有助于区分肿瘤克隆进化过程中的早期事件和晚期事件，靶向主要驱动基因克隆突变(早期事件)是一种较好的治疗策略[35-38]。一些驱动基因突变在多灶HCC中显示为克隆突变，如TERT、CTNNB1、TP53和BRAF，被认为是HCC复发的典型驱动基因[18,39-40]。通过全外显子测序，研究人员还发现53.8%的致癌突变表现为亚克隆，位于进化树的分支上[20]。多灶HCC的克隆和分支进化是HCC精准靶向治疗的一大障碍。对于有手术机会的多灶HCC患者，对其所有病灶进行敏感靶点的检测，寻找进化树树干上的共有敏感靶点，进行精准靶向治疗，有望预防肿瘤复发。

2 多灶HCC的转录组特征

2.1 多灶HCC的RNA表达特征及通路分析 随着RNA测序技术在多灶HCC的肿瘤组织和癌旁肝组织的应用，多灶HCC的转录组特征逐渐被揭示[23,31]。通过比较肿瘤和癌旁组织的基因表达水平，可鉴定上调和下调的基因种类和变化比率，进一步分析肿瘤的特征性基因变化谱。作者团队通过基因本体分析发现多灶HCC中主要富集免疫反应和代谢过程相关的基因集[23]。同样地，Miao等[31]也发现在多灶肝癌中免疫反应和代谢通路得到富集，这一结论在HCC的大规模多组学整合研究[40]中也得到了验证，表明免疫和代谢这两个通路的调节机制对于多灶HCC发生发展具有重要作用。Zhang等[32]报道了1例有9个病灶的多灶HCC，通过KEGG通路分析发现不同的病灶有着显著不同的富集通路，但来自于相同病灶的取材点在转录组水平则更为相似，提示病灶间的异质性大于病灶内的异质性，这可能预示着在治疗反应过程中，同一病灶的表型可能更为一致，而不同病灶则会存在差异，从而产生混合效应。作者在多灶HCC的大癌灶中发现更多的增殖相关通路富集，例如血管新生、血管内皮生长因子、PI3K-AKT等信号通路，而小癌灶则有更多的免疫相关通路富集，例如TNFα、IFNα、T淋巴细胞和B淋巴细胞受体信号通路等[24]。这些结果部分解释了临床多灶HCC患者在接受靶向治疗或者免疫治疗时不同病灶疗效的异质性。

在前期的转录组数据分析中，作者发现Edmondson-Steiner分级为2级和3级HCC患者的RNA表达谱存在明显的区别，提示RNA表达与肿瘤分化程度相关[23]。HBV相关HCC患者的临床预后可以从转录组分析角度去判断：细胞骨架的重构和细胞外基质的组装与肿瘤转移相关，临床预后不佳可能与细胞增殖、核酸代谢、蛋白翻译以及大分子组装相关，提示RNA表达与肿瘤的临床病理特征和预后相关[31]。此外，多组学分析可以预测多灶HCC的肿瘤增殖和侵袭能力，为术后的辅助治疗提供指导[19]。因此，多灶HCC的RNA表达分析具有临床预后的预测潜力，在临床实践中的应用前景十分广泛。

RNA表达受到许多因素的影响，包括基因组和表观遗传的调控。RNA表达很大程度上受到基因组拷贝数的影响[31]，也可能源于甲基化水平的不同。Ding等[41]发现，早在多灶HCC发生之前，肝硬化或者纤维化的结节中已经发生了特征性的DNA 甲基化，并在肝脏中形成“场效应”，为肿瘤的发生和发展提供了具有选择性的生存优势。此外，RNA表达调控的其他表观遗传修饰例如m6A和m7G等研究也在探索中，相关机制的揭示有望为HCC的治疗带来突破。

2.2 多灶HCC转录组特征对精准免疫治疗的指导意义

免疫治疗在HCC治疗中有着很好的应用前景，但其较低的反应率和不同病灶的混合效应仍然是目前面临的最主要挑战，HCC患者不同的癌灶间存在显著不同的免疫微环境，包括免疫效应细胞、免疫抑制细胞、基质细胞、细胞因子、生长因子等，共同塑造了多灶肝癌免疫微环境的异质性。因此，从多灶HCC的免疫特征层面理解其免疫逃逸机制并开发更有效的免疫治疗极为重要[4]。多灶HCC在转录组水平的解析可为临床实践提供有价值的参考信息。分析多灶HCC的RNA表达谱，一方面可以开发潜在的治疗靶点，另一方面也有助于预测术后肿瘤进展或复发[31]。

不同起源模式的多灶HCC有着不同的免疫微环境特征。Dong等[4]发现IM-HCC 病灶中T淋巴细胞浸润减少，而M2型巨噬细胞浸润增加。相比之下，在MO-HCC中免疫检查点抑制性分子的表达更多。IM-HCC有更多共有的新生抗原和T淋巴细胞(抗原)受体库，而MO-HCC则很少。此外，由于MO-HCC免疫浸润较低，所以会发生更多的免疫编辑。笔者团队发现多灶HCC中存在显著的免疫异质性，体现在免疫分子表达水平上的差异，但有趣的是，CD8+T淋巴细胞富集结节中，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4和PD-1、PD-L1等抑制性免疫分子的表达也同样升高，使得浸润的CD8+T淋巴细胞难以发挥抗肿瘤功能[23]，因此，对于CD8+T淋巴细胞高浸润的患者，进行PD-1/PD-L1抑制剂治疗可以缓解其免疫抑制状态，从而增强浸润CD8+T淋巴细胞的杀伤能力。此外，作者发现与同一多灶性HCC病例中的大癌灶相比，小癌灶具有更多的免疫细胞浸润和免疫通路上调，这可能部分解释了为何小癌灶和大癌灶在抗PD-1治疗时反应不同[24]。

近期一项多灶HCC的研究将HCC分为3个亚型：免疫健全型、免疫缺陷型、免疫抑制型，不同的亚型中免疫细胞的组成差异较大，为将来的研究提供了很好的分类参考。免疫健全型具有正常的T淋巴细胞浸润，但B淋巴细胞浸润少；免疫缺陷型的淋巴细胞浸润较少，但有较多的树突状细胞和自然杀伤细胞；免疫抑制型中调节性T淋巴细胞、调节性B淋巴细胞和M2型巨噬细胞较多，同时伴随PD-1、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4以及Tim-1的表达上调[32]。此外，CD45和Foxp3可以作为简单有效的免疫治疗预测标志物，提示免疫异质性分析对指导免疫治疗具有重要意义。

3 小结

综上所述，针对多灶HCC患者进行不同或联合的免疫治疗时需要考虑多灶HCC免疫微环境的异质性[24,32]。采用免疫检查点抑制剂单药或联合靶向药物治疗的个体化免疫治疗策略是多灶HCC患者获得更好临床疗效的重要环节。