不同促渗剂对右旋酮洛芬氨丁三醇水凝胶贴剂透皮吸收的影响

陈永顺，杨金霞，王启斌

（湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰442000）

右旋酮洛芬氨丁三醇（DKT）是具有苯丙酸结构的非甾体抗炎药，具有抗炎、抗风湿和镇痛药理活性[1-2]。但其半衰期较短，有效血药浓度维持时间有限，对胃肠道刺激性较大。水凝胶贴剂具有无刺激性、载药量大、透皮效果好、生物利用度高及透气性好等优点[3]。将DKT制成水凝胶贴剂，可发挥长效镇痛作用，减少胃肠道不良反应。皮肤的屏障作用限制了大多数药物的有效吸收，故在贴剂的处方中会添加合适的促渗剂，以促进药物的透皮吸收。目前，常用促渗剂有尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮等。在前期试验[4]的基础上，本研究中采用体外透皮吸收法，考察一元促渗剂及多元促渗剂对DKT水凝胶贴剂的促渗作用，以优选促渗剂；同时研究了DKT水凝胶贴剂（无促渗剂组和含促渗剂组）在比格犬体内的药代动力学，考察其体内促渗效果。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

Waters 600型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；改良Franz扩散池（自制）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司，精度为0.000 1 g）；TGL-16BG型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；SK-1型快速混匀器（天津药典标准仪器厂）；氮气吹干仪（上海郓曹电子科技有限公司）。

1.2 试药

右旋酮洛芬氨丁三醇（武汉远成共创科技有限公司，批号为20190215）；右旋酮洛芬氨丁三醇对照品（中国药品生物制品检定所，批号为180316-20150，纯度为99.36%）；萘普生钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100330-200702）；聚丙烯酸Viscomate NP800（山东精细化工有限公司，批号为20180926）；氮酮（浙江利康化工有限公司，批号为20190621）；EDTA（天津市百世化工有限公司，批号为20080609）；聚维酮K-90（国药集团化学试剂有限公司，批号为7600162502）；尿素（青岛海洋化工厂，批号为20081126）；甘羟铝（批号为20190618）、丙二醇（批号为20190118）均购自天津市福晨化学试剂厂；油酸（批号为20190230）、N-甲基吡咯烷酮（批号为20190619），均购自天津市博迪化工有限公司；乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 动物

Wistar大鼠，雄性，体质量为（200±20）g，动物合格证号为SCYY（鄂）2019-0011；比格犬，6只，雌雄各半，体质量为（15±0.2）kg，动物合格证号为SCYY（鄂）2019-0028。所有动物均由湖北医药学院实验动物中心提供，试验的操作规程和协议都按照湖北医药学院动物保护和使用委员会颁布的试验动物使用和保护指导守则进行。Wistar大鼠和比格犬每天供给统一的饲料和水，饲养温度为室温（20～24℃）。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件[5]

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×6.0 mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲溶液（68 g磷酸二氢钾溶于1 000 mL水中，磷酸调节pH至3.5）-乙腈-水（2∶43∶55，V/V/V）；测定波长：257.00 nm；流速：1 mL/min；进样量：20μL；柱温：35℃。

2.1.2 溶液制备与测定

取DKT对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成质量浓度为800 mg/L的对照品溶液，备用。取DKT对照品溶液、空白贴剂（阴性对照品溶液）和DKT贴剂的透皮吸收试验的接收液（供试品溶液），经0.22μm微孔滤膜过滤，按拟订色谱条件进样分析。DKT的保留时间为9.26 min，色谱图见图1。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：将对照品溶液用流动相稀释为质量浓度分别为2，10，20，100，200，400，800 mg/L的系列溶液。分别取20μL，注入色谱仪，按拟订色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X，mg/L）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=9 258X-165（r=0.999 8）。结果表明，DKT质量浓度在2～800 mg/L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取质量浓度为100 mg/L的对照品溶液，按拟订色谱条件进样20μL，连续测定3 d。结果DKT的日内RSD和日间RSD分别为0.21%和0.48%（n=6），表明仪器精密度良好。

（2）教师要深入把控教学生成问题。“植物的生殖”一课中，教师采用了生物学中常用的对比学习法，对有性生殖和无性生殖两种生殖方式在形成过程、遗传特性、与母体的性状一致性和后代个体变异等多个方面进行对比的同时，让学生体会到两种生殖方式各有利弊，从而知道：人们应当趋利避害，取长补短，在植物不同的生命阶段，采用不同的生殖方式以繁衍后代。在课堂中，教师还需分配更多时间、列举更多例子来帮助学生分析和理解为了适应环境以实现种族的繁衍，两种生殖方式应当如何合理搭配应用，将理论联系生活实际，服务于农业生产。

加样回收试验：精密吸取已知含量的DKT供试品溶液1.0 mL，置10 mL刻度管中，共9份，每组3份，分别精密加入100 mg/L的对照品溶液0.2，0.4，0.6 mL，各3份，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，按拟订色谱条件进样20μL，测定峰面积。结果DKT的平均加样回收率为98.22%，RSD为1.86%（n=9）。

稳定性试验：取质量浓度为100 mg/L的对照品溶液20μL，分别于0，4，6，12，24 h时进样测定。结果含量的RSD为0.23%（n=6），表明DKT对照品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2 DKT水凝胶贴剂制备[4]

称取聚维酮K-90 2 g，EDTA 0.15 g，溶于63.05 g纯化水中，加入DKT原料药2.5 g，搅拌均匀，作为A相；取25 g甘油，依次加入促渗剂适量、甘羟铝0.3 g、聚丙烯酸Viscomate NP-800 5 g，搅拌均匀，作为B相，处方总量100 g。取大小合适的搅拌锅，加入B相，搅拌15 min后倒入A相，继续搅拌1.0 h，静置0.5 h，均匀涂于无纺布上，盖上背衬，室温放置2 h，即得。每片贴剂剪裁为5 cm×10 cm大小，含DKT 0.25 g，含药膏质量10 g。

2.3 体外经皮渗透试验[4]

图1高效液相色谱图

取处理好的Wistar雄性大鼠腹部离体全皮，固定于改良Franz扩散池（有效扩散面积为1.5 cm2）的两室之间，角质层面向供给室，将DKT水凝胶贴剂贴在皮肤角质层面上。接受池中加入50 mL PBS缓冲液（pH=7.4）作为接受液，保持磁力搅拌速率为300 r/min，恒温水浴为（32±0.5）℃。分别于试验开始后的1，2，4，6，8，10，12，24 h从接受池中取样0.5 mL，同时补充0.5 mL PBS缓冲液。样品经0.45μm微孔滤膜过滤，按拟订色谱条件进样测定，计算药物浓度，根据公式[Qn=其中，A为有效扩散面积，V为取样体积，V0为接受液总体积，Cn和Ci分别是第n个和第i个取样点的药物浓度]，计算药物单位面积的累积经皮渗透量（Qn），以Qn对时间作图，并对直线进行线性回归，直线的斜率为渗透速率。

2.4 不同促渗剂对DKT水凝胶贴剂透皮吸收的影响

2.4.1 促渗剂种类及浓度选择

常用的促渗剂包括有机溶剂类（乙醇、丙二醇、醋酸乙酯、二甲基亚砜及其同类物质）、有机酸、脂肪醇类（油酸、亚油酸、月桂醇）、氮酮及其同系物、表面活性剂、角质保湿与软化剂类（尿素、水杨酸、吡咯酮类）、萜烯类（薄荷醇、樟脑、柠檬烯）等。参考文献[5-13]，选择常用促渗剂尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮考察其对DKT水凝胶贴剂透皮吸收的影响。促渗剂常用剂量结合试验中的实际情况，设置以下不同的质量分数进行试验：5%，10%的尿素；3%，5%的油酸；2%，4%的氮酮；3%，5%的薄荷醇；10%，20%的丙二醇；3%，5%的N-甲基吡咯烷酮。

2.4.2 一元促渗剂的影响

按2.4.1项下选择促渗剂及不同质量浓度，以不加促渗剂作为空白对照组，计算其累积透过量、稳态渗透速率及促渗倍率。结果见表1。结果显示，除尿素外，油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮对DKT均有一定促渗作用。以4%氮酮的作用最强，10%丙二醇作用次之，促渗效果依次为4%氮酮＞2%氮酮＞10%丙二醇＞5%薄荷醇＞5%丙二醇＞5%油酸＞5%N-甲基吡咯烷酮＞3%薄荷醇。而尿素则显示了一定程度的抑制作用，且随着质量浓度的增加，抑制作用增强。

表1一元促渗剂作用下的DKT透皮渗透速率（n=3）

根据一元促渗剂试验结果选择合适的促渗剂进行联用，参考文献[14-16]，丙二醇具有较好促渗作用，又能增加DKT的溶解度，故主要考察丙二醇与其他促渗剂联合使用的效果。根据2.4.2项下试验结果分别设置以下试验组：5%油酸+10%丙二醇、5%尿素+10%丙二醇、4%氮酮+10%丙二醇、5%薄荷醇+10%丙二醇及5%N-甲基吡咯烷酮+10%丙二醇。按2.3项下方法进行体外透皮渗透试验，以不加促渗剂作为空白对照组，计算其累积透过量、稳态渗透速率及促渗倍率。结果见表2。可见，丙二醇联合其他促渗剂的促渗效果明显优于单一促渗剂，其中以4%氮酮+10%丙二醇联合使用促渗透作用最强，其促渗倍率提高至无渗透促进剂的3.22倍。

表2多元促渗剂作用下的DKT透皮渗透速率（n=3）

2.5 DKT水凝胶贴剂药代动力学研究[17-18]

2.5.1 色谱条件[19]

色谱柱：Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：5 mol/L磷酸盐缓冲溶液-乙腈（73∶27，V/V）；测定波长：260 nm；流速：1 mL/min；进样量：20μL；柱温：35℃。

2.5.2 血浆样品处理

取比格犬血浆200μL，置离心管中，加入10μL萘普生钠内标溶液（250μg/mL），振荡，混匀。加入0.1 mL盐酸（0.1 mol/L），涡旋混匀1 min，加入乙醚3 mL，涡旋混匀3 min。吸取上清液2 mL置离心管中，40℃氮气仪吹干。残渣加入200μL甲醇溶解，涡旋混匀1.0 min，12 000 r/min离心5.0 min，取上清液20μL，0.22μm微孔滤膜滤过，按拟订色谱条件进样测定。

2.5.3 方法专属性考察

图2高效液相色谱图

取DKT对照品100 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为1 000μg/mL的DKT对照品贮备液。用甲醇稀释成质量浓度为100，50，10，5，2.5，1.25，0.625μg/mL的对照品系列溶液，置4℃下保存，备用。取萘普生钠对照品100 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成质量浓度为1 000μg/mL的萘普生钠对照品贮备液，用甲醇稀释成质量浓度为250μg/mL的内标溶液，置4℃下保存，备用。分别取比格犬空白血浆，加有DKT和内标萘普生钠对照品贮备液的空白血浆和样品血浆，按2.5.2项下方法处理，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。可见，血浆内源性物质不干扰DKT及内标萘普生钠的测定，DKT的保留时间为10.45 min，内标萘普生钠的保留时间为8.23 min。详见图2。

2.5.4 方法学考察

线性关系考察：取比格犬空白血浆200μL，分别加入2.5.3项下对照品系列溶液20μL，配成10，5，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5μg/mL的标准血浆样品，按2.5.2项下方法处理，测定DKT与萘普生钠的峰面积。以DKT的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、DKT与萘普生钠的峰面积比为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得标准曲线方程Y=17 862X-2 438.6（r=0.998 2）。结果表明，DKT质量浓度在0.062 5～10.0μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别取比格犬空白血浆200μL若干份，加入不同质量浓度的DKT对照品溶液，制成高、中、低3个质量浓度（5，0.5，0.125μg/mL）的血浆样品，混匀后按2.5.2项下方法处理并进样分析。每个质量浓度配制3个样本，连续测定3 d，日内及日间各重复5次。结果的RSD均小于4.86%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：将高、中、低3个质量浓度的血浆样品分别于室温放置24 h、-20℃冰箱保存24 h、冻融循环（-20℃）3次后，分别按2.5.2项下方法处理。结果血浆样品DKT含量的RSD均小于4.92%（n=5），表明24 h内血浆样品稳定性良好。

提取回收率试验：取高、中、低3个质量浓度（5，0.5，0.125μg/mL）的血浆样品，按2.5.2项下方法处理，取20μL进样，得DKT峰面积为A1，另取DKT相同质量浓度标准溶液直接进样，所得峰面积为A2，依法计算提取回收率。结果提取回收率在92.52%～94.68%之间。

2.5.5 给药方案与血样采集

取健康比格犬6只，随机分为两组，每组3只，一组为无促渗剂DKT水凝胶贴剂，另一组为DKT水凝胶贴剂（含4%氮酮+10%丙二醇）。给药前2 d于犬左上腹部剃毛，饲养待用，腹部剃毛区紧密贴敷DKT水凝胶贴剂，给犬穿上棉质背心以防贴剂被撕落。给药前12 h禁食不禁饮。分别于给药前和给药后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24 h时从犬前肢内侧下静脉取血2 mL。按2.5.2项下方法处理，HPLC法测定血药浓度，并绘制血药浓度-时间（C-t）曲线，见图3。可见，DKT水凝胶贴剂的达峰时间较长，且能较长时间内维持较高血药浓度，具有缓释药特征；两者0～24 h药时曲线下面积（AUC0→24h）差异显著，含促渗剂的DKT水凝胶贴剂是无促渗剂的2.48倍，表明两者体内促渗倍率达2.48倍，含4%氮酮+10%丙二醇促渗剂的DKT水凝胶贴剂具有较好的透皮吸收性能。

图3右旋酮洛氛氨丁三醇在比格犬体内平均血药浓度-时间曲线图（n=3）

采用DAS2.0药代动力学软件对药物浓度-时间数据进行处理，对血药浓度数据进行曲线拟合，其药代动力学参数见表3。应用SPSS13.0统计学软件对两组贴剂的主要药动学参数进行分析，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。DKT水凝胶贴剂给药后的平均血药浓度-时间曲线均符合二室模型。与无促渗剂组相比，DKT水凝胶贴剂达峰浓度（Cmax）及AUC0→24h均显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3比格犬给药后主要药代动力学参数（±s，n=3）

表3比格犬给药后主要药代动力学参数（±s，n=3）

注：与DKT水凝胶贴剂（无促渗剂）比较，*P＜0.05。tmax为达峰时间，Cmax为峰浓度，t1/2α为分布相半衰期，t1/2β为消除相半衰期，AUC为血药浓度-时间曲线下面积，MRT为平均滞留时间。

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3 讨论

对于透皮性差的药物，促渗剂发挥着重要作用，选择合适的促渗剂是制剂研究中非常重要的一环。目前，促渗剂既可单独使用，也可联合使用。本研究中考察了一元促渗剂及多元促渗剂对DKT水凝胶贴剂的影响，结果表明，联合使用促渗剂的促渗效果明显优于单一促渗剂。其中，4%氮酮联合10%丙二醇的促渗透作用最强。氮酮主要作用于细胞脂质双分子层，对生物膜类脂具有特异性溶解和破坏作用，能增加类脂膜的不连续性，对亲水性药物的促渗作用较强。丙二醇增加促渗剂及药物溶解度的同时可发挥协同作用，可渗入皮肤，溶解α-蛋白，并与之形成氢键，减少α-蛋白与药物的结合，从而促进药物的透皮吸收，但高浓度的丙二醇可能对皮肤产生伤害及刺激[20]。氮酮与丙二醇联合使用产生协同作用，其促渗倍率提高至无渗透促进剂的3.22倍，可以选择其作为DKT水凝胶贴剂的促渗剂。以5%尿素+10%丙二醇的效果最差。尿素作为角质层水化剂，显示出渗透抑制作用，且随着浓度的增加抑制作用增强，作用机制尚不清楚，与丙二醇合用后，两者的联合促渗透作用有所提高。此外，5%油酸、5%薄荷醇及5%N-甲基吡咯烷酮与丙二醇合用后，促渗透能力均有较大幅度提升。

在DKT水凝胶贴剂的处方研究中，本研究中重点考察了不同促渗剂及其联用对DKT透皮吸收的影响，以离体皮肤为参考，本研究中进一步考察了该贴剂在大鼠体内的药代动力学参数，可为临床应用提供参考。

DKT水凝胶贴剂在比格犬体内符合二室模型，含促渗剂组与无促渗剂组的药代动力学参数AUC0→24h分别为（26.22±1.17）mg·h/L、（10.56±0.32）mg·h/L，两者比值为2.48，表明含促渗剂体内促渗倍率达2.48倍，与体外试验促渗倍数（3.22倍）相比有差异，说明透皮吸收体内与体外试验具有相关性，但有一定差异。