一种快速测定苦丁茶中苦丁茶皂苷A含量的方法

摘 要：建立一种高效液相色谱法快速测定苦丁茶中苦丁茶皂苷A含量，采用Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流动相为乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱;流速为0.8 mL/min;检测波长226 nm;柱温30 ℃;进样量10 ?L。结果表明，苦丁茶皂苷A在进样量0.102～3.06 ?g/mL范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为99.6%，RSD为0.86%（n=6）。该方法精密度高，简便快捷，具有良好的重复性和稳定性，可为评价苦丁茶质量提供参考。

关键词：苦丁茶;苦丁茶皂苷A;含量测定

苦丁茶是一种纯天然保健茶。冬青科冬青属植物苦丁的干燥叶，是正品苦丁茶的主要来源，主产于广东省、广西壮族自治区和海南省等地。苦丁茶中主要含有皂苷、黄酮、多酚、氨基酸、挥发油与多糖等多种化学成分，其中，三萜皂苷类化合物是其主要活性成分，有显著降低低密度脂蛋白在血管内沉积，改善血液微循环的药理活性，对降压、降糖、降血脂、防治动脉粥样硬化以及由此引发的心脑血管疾病有积极治疗意义[1-2]。目前，苦丁茶的质量分析主要集中在测定黄酮、三萜、氨基酸、挥发性成分等方面[3]。本实验结合苦丁茶的功效，选取其中含量高、降血脂活性强的三萜皂苷类成分苦丁茶皂苷A为指标，用高效液相色谱法进行测定，为全面客观反映苦丁茶的质量优劣，合理制定苦丁茶等级标准提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1100 型高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站，Sartorius-BS110S 电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司），KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超聲仪器有限公司）。

苦丁茶皂苷A（kudinoside A）对照品为实验室自制，经HPLC法检测质量分数在98.0%以上;乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。10批不同等级品次的苦丁茶样品主要购买收集自广西、海南、广东。

2 方法与结果

2.1 提取条件优化

分别从提取方法、提取溶剂、提取时间、固液比4方面进行研究。首先以60%甲醇作溶剂用回流和超声法进行实验检测，显示回流法提取优于超声法。又考察不同浓度甲醇和乙醇对提取的影响，显示80%甲醇与60%甲醇对苦丁茶皂苷A的提取率远高于其他溶剂，从经济上考虑，确定60%甲醇为提取溶剂。进一步考察不同固液比、提取时间的影响，显示以固液比1∶250，用60%甲醇回流提取1 h，待测成分提取效果最好。

2.2 色谱条件优化

为获得苦丁茶皂苷A的最佳分离效果，实验考察了4种不同的液相色谱柱、4种不同的流动相、不同的柱温以及不同流动相的流速等色谱条件。结果表明：Kromasil 100-5C18柱的分离效果最优;采用乙腈-0.1%磷酸水为流动相，0.8 mL/min的流速梯度洗脱，柱温30 ℃，可以使苦丁茶皂苷A的色谱峰保留时间适中，并能与干扰组分的色谱峰良好分离。

2.3 检测波长的选择

取苦丁茶皂苷A对照品甲醇溶液进行波长扫描，在226 nm波长处有最大吸收，故确定226 nm作为检测波长。

2.4 色谱条件

Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱。流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，15%～30% A;10～30 min，30%～40% A;30～35 min，40% A。体积流量：0.8 mL/min。检测波长：226 nm。柱温：30 ℃。进样量：10 ?L。高效液相色谱图见图1。

2.5 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的苦丁茶皂苷A对照品适量，加入60%甲醇溶解、定容，制成浓度为0.510 mg/mL的对照品储备液，低温保存备用。

2.6 供试品溶液的制备

取粉碎、过40目筛并低温干燥至恒重的苦丁茶粉0.1 g，加入60%甲醇25 mL，称定质量，80 ℃加热回流60 min，取出，自然放冷至室温，以60%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 ?m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.7 线性关系考察

精密吸取对照品储备液1 mL，以60%甲醇定容于5 mL容量瓶中，再分别精密吸取苦丁茶皂苷A对照品溶液（0.051 0 mg/mL）1、5、10、15、20、25 ?L与30 ?L，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y=489.55X-0.59，r=0.999 9。

结果表明苦丁茶皂苷A进样量在0.102～3.06 ?g/mL时，呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，测定苦丁茶皂苷A峰面积，计算RSD为0.47%，表明本方法精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一批苦丁茶样品6份，按2.6项下方法平行制备6份供试样品溶液，分别进样10 ?L，计算苦丁茶皂苷A的质量分数，平均结果为2.56%，RSD为1.12%，表明本方法重复性良好。

2.10 稳定性试验

取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h依次进样，记录不同时间的色谱图，计算苦丁茶皂苷A的峰面积RSD为1.54%，RSD值≤2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.11 回收率试验

取广西大新苦丁茶样品粉末6份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入0.051 0 mg/mL的苦丁茶皂苷A对照品甲醇溶液25 mL，按2.6供试品溶液制备方法制备并测定，平均回收率为99.6%（RSD=0.86%）。

2.12 样品测定

取不同产地与等级苦丁茶样品，制备供试品溶液。分别精密吸取苦丁茶皂苷A对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算苦丁茶皂苷A含量，见表1。

3 结果与讨论

实验显示：①来自3个不同产地、相同等级苦丁茶中指标成分苦丁茶皂苷A的含量差异不大，但是来自同一产地海南、不同等级苦丁茶中指标成分含量有一定差异，从数据上可以明显看出，普通级>一级>特级>极品，这可能与不同等级苦丁茶烘焙加工温度有密切关系，随着烘焙温度的提高，苦丁茶皂苷A的含量降低，后期需进一步实验验证。②茶叶碎屑中含有较多的苦丁茶皂苷A，将苦丁茶冬青叶开发为新的降血脂药物而言，茶叶碎屑都可用作原料，利于降低开发新药的成本。③苦丁茶冬青老龄叶与嫩叶中指标成分含量差异较大，但老龄叶中所含其他化学成分是否与嫩叶有差异，还有待研究。

本实验建立的测定方法简便，准确可靠，重复性好，可考虑作为苦丁茶质量优劣的检测控制标准。根据实验结果，若以苦丁茶干燥品计算，其所含主要活性成分苦丁茶皂苷A限度标准可暂定为不低于20 mg/g。

参考文献

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[2]胡婷.苦丁茶中有效成分的分离纯化、鉴定及其活性研究[D].广州：华南理工大学，2013.

[3]樊伟伟，何进武，陈冬梅，等.海南苦丁茶几种活性成分测定与比较分析[J].食品工程，2017（3）：62-64.

基金项目：国家自然科学基金资助课题（编号：81560643）。

作者简介：吕华瑛（1971—），女，山东莱阳人，硕士，教授。研究方向：中药化学成分研究与质量控制。