食品大肠菌群检验中培养基验证方法的探讨

谢甜 陈亚

摘 要：培养基的质量直接关系到检验结果的准确性，在实验开始前进行培养基的验证具有极其重要的意义;GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》检测标准中的检测方法主要涉及结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）这3种培养基，通过对这3种培养基的验证，评价培养基是否满足实验需要;并对可能造成培养基验证结果不准确的因素进行分析讨论。

关键词：食品;大肠菌群;培养基;验证

培养基是微生物检验中的主要耗品和材料。从培养基自身的质量来看，不同生产厂家的产品，甚至同一厂家不同批号的产品都会存在差异;依据GB/T 27050-2008《检测和校准实验室能力的通用要求》，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商，这是培养基购买过程中的重要步骤。做好培养基和试剂的检查工作，对确保微生物的生长、分离、鉴定与检验结果的正确性具有关键性的作用。因此，需要对培养基和试剂的质量进行检查，以控制好培养基和试剂的质量[1]。培养基验证是微生物实验室质量控制的关键环节，验证结果直接影响检验结果的准确性和质量，而大肠菌群是最为常见的检测项目也是必检项目，与人们的饮食健康息息相关，因此大肠菌群检测的准确性至关重要[2]。参照GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[3]，从食品大肠菌群检验中培养基的验证入手，阐述培养基验证的具体操作流程，为实验室内部的质量控制提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

1.1.1 待验证培养基

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），批号：190812，厂家：北京陆桥技术股份有限公司;月桂基磺酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），批号：180509，厂家：北京陆桥技术股份有限公司;煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB），批号：190517，厂家：北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.2 其他培养基（已验证合格的培养基）

营养肉汤，批号：190829，北京陆桥技术股份有限公司;营养琼脂，批号：190422，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 菌株信息

大肠埃希氏菌CICC 10305，中国工业微生物菌种保藏管理中心;粪肠球菌CICC 23658，中国工业微生物菌种保藏管理中心;弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864，KWIKSTIK。

1.3 仪器与设备

BSP-400L培养箱（S.15.17），上海博讯实业有限公司医疗设备厂;BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（S.17.3），苏州安泰空气技术有限公司。

2 培养基验证方法

2.1 培养基制备

将VRBA培养基制好后倒入平皿，冷却备用。将LST培养基分装试管，每管10 mL;将BGLB培养基分装试管，每管10 mL。灭菌后备用。

2.2 工作菌悬液制备

菌悬液A：将大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和粪肠球菌菌株分别接种到营养肉汤中，36 ℃下培养24 h，即得3种工作菌悬液A。

菌悬液B：菌悬液A中的这3种工作菌悬液分别稀释10、100、1 000与10 000倍，制备浓度为105～107 CFU/mL的菌悬液作为工作菌悬液;大肠埃希氏菌106 CFU/mL为工作菌悬液适宜浓度。弗氏柠檬酸杆菌，106 CFU/mL为工作菌悬液适宜浓度。粪肠球菌105 CFU/mL为工作菌悬液适宜浓度。

2.3 VRBA培养基验证

2.3.1 生长率测试

接种：用1 μL接种环分别挑取菌悬液A中的大肠埃希氏菌菌悬液和弗氏柠檬酸杆菌菌悬液各一环在VRBA平板上划线，各接种两个平板，按图1所示;在36 ℃培养箱培养24 h。

计算：每条有比较稠密菌落生长的划线则生长指数G为1;仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5;若划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0;记录每个平板的得分总和便得到G总。

VRBA生长率测试实验结果如下。

大肠埃希氏菌（平均值）G总=7.5（要求G总≥6），特征性反应：大肠埃希氏菌有沉淀环的紫红色菌落。

弗氏柠檬酸杆菌（平均值）G总=7（要求G总≥6）。

2.3.2 选择性测试

接种：用1 μL接种环取菌悬液A中的粪肠球菌工作菌悬液1环，在VRBA平板上划线，如图2，同时接种两个平板。在36 ℃培養箱培养 24 h。

计算：每条有比较稠密菌落生长的划线则生长指数G为1;仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5;若划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0;记录每个平板的得分总和便得到G总1。

VRBA选择性测试实验结果：粪肠球菌（平均值）G总1=3;（要求G总1<5）。

2.4 LST培养基验证

2.4.1 测试

用1 μL接种环各取一环菌悬液B直接接种到LST培养基中，在36 ℃培养48 h。

2.4.2 结果解释

目测浊度值评估培养基，0表示无混浊;1表示很轻微混浊;2表示严重的混浊。

生长率：大肠埃希氏菌浊度值=2（产气）;弗氏柠檬酸杆菌浊度值=2（产气）。

选择性：粪肠球菌浊度值=0。

2.5 BGLG培养基验证

方法与LST培养基验证完全相同。

3 结论与分析

3.1 VRBA培养基验证结论

3.1.1 标准要求

生长率测试：大肠埃希氏菌G≥6，且在VRBA平板上有特征性反应;选择性测试：弗氏柠檬酸杆菌G≥6，粪肠球菌G<5。

3.1.2 结论

VRBA培养基验证结果满足上述要求，验证结论合格。

3.2 LST培养基验证结论

3.2.1 标准要求

大肠埃希氏菌：混浊度为2，且管内有气体;弗氏柠檬酸杆菌：混浊度为2，且管内有气体;粪肠球菌：浊度0（不生长）。

3.2.2 结论

LST培养基验证结果满足上述要求，验证结论合格。

3.3 BGLB培养基验证结论

标准要求与LST一样，验证结论为合格。

3.4 分析讨论

培养基验证过程中，也会出现不满足实验要求的情况，应该从以下几个方面考虑：①试验菌种，试验菌种是否是目标菌，这一点涉及菌种的验收是否合格，此外还要考虑菌种是否具有较强的生长力，最好是新鲜活化的。②操作规范，因为涉及3种菌株，在生物安全柜中同时操作极易造成交叉污染，对实验准确度的影响极大，建议在不同的生物安全柜中操作，条件不允许的情况下可以分批次进行菌悬液的制备。③培养基自身的质量问题。对微生物检验来说，主要采用商品化脱水合成培养基。因此在采购商品化脱水合成培养基时，应仔细检查外观产品批号、有效期、培养基的pH值、包装完整性等等，做好接收记录。对于新开封的培养基，应记录首次开封日，并在开封后6个月内用完。

4 结论

微生物种类很多且较复杂，检验结果的真实性与准确度会受到培养基质量的直接影响，培养基的验证是内部质量控制的重要一环，本次实验对GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》中阐述的方法进行了细化，对实验的可操作性进行了全面而具体的分析，尽管本次实验的结果是满意的，但实验中还是存在各种风险，对实验中的注意事项和可能存在的风险进行了总结与分析，为实验室内部质量控制提供了良好的依据。

参考文献

[1]林耀文，范安妮，刘海卿，等.浅谈加强食品微生物检验质量控制的措施[J].生物技术世界，2014（8）：53.

[2]游元丁，赵阳，徐梦怀，等.奶粉中沙门氏菌检测能力验证分析[J].安徽农业科学，2019，47（5）：193-195.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委員会.GB 4789.28-2013 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S].北京：中国标准出版社，2013.