白细胞分化抗原151促进人结直肠癌细胞系HT29的增殖及侵袭

刘学刚，刘艳彩，吴春平，李景光，赵岭岭，张 浩，张振亚

(衡水市第四人民医院 1.普外科; 2.病理科， 河北 衡水 053000; 3.河北医科大学第四医院 外二科,河北 石家庄 050000)

在中国，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道肿瘤，其发病率和病死率一直居高不下。据统计，全国每年约有37.6万人发病，19.1万人死亡，严重影响人类健康[1]。所以寻找新的肿瘤标志物以及新的治疗靶点至关重要。

作为四跨膜蛋白家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)成员之一，CD151(白细胞分化抗原151)在多种肿瘤中呈高表达，如乳腺癌[2]、前列腺癌[3]及结直肠癌[4]，能够促进癌细胞的增殖、侵袭，并且在血管增生中扮演着重要的角色[5-6]，在肿瘤的进展中发挥着重要的作用。大量研究表明，CD151在结直肠癌组织中高表达，可以作为潜在的标志物，然而CD151在结直肠癌中所发挥的功能鲜有报道。以此为出发点，作者接下来将要在结直肠癌中对CD151的功能展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人结直肠癌细胞系HT29及CD151-HT29细胞(河北中医学院药理实验室),慢病毒(汉恒生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂：DEME培养基 (杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶 (上海源叶生物科技有限公司)；BCA蛋白分析试剂盒 (Thermo Fisher公司)；β-actin抗体 (Abcam公司)；Trizol裂解液 (Becton-dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组：将人结直肠癌细胞系用10%胎牛血清的DMEM培养基培养。放于细胞培养箱中培养。待细胞增殖至80%汇合度时，将细胞用胰蛋白酶消化，离心，无菌PBS洗2遍，培养基重悬，重新铺到新的细胞培养皿中，每1 d换液1次，取对数增殖期的细胞用于实验。

1.2.2 Western blot检测CD151蛋白：提取蛋白质，使用BCA法测蛋白质浓度，确定并统一SDS-PAGE凝胶电泳上样量。取30 μg样品蛋白加入等量的2×上样的缓冲溶液，混匀煮沸10 min, 上样, 80 V恒压电泳直至溴酚蓝刚从胶中跑出。电泳结束后进行转膜90 min，0.35 A。经封闭液封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育后进行曝光。

1.2.3 实时定量PCR检测mRNA：提取RNA，将提取出来的总RNA反转录为cDNA。根据NCBI Gene Bank内提供的基因序列, β-catenin引物序列为：上游引物：5′-GCTACTTGTGAGTGAAG-3′，下游引物为:5′-ATGGAACCAGACAGAAAAGC-3′。CD151引物序列为：上游引物：5′-GAGGTCTATGGGTGAGT TCAACGAG-3′，下游引物：5′-AATTCCTCAGGCGT AGTC-3′。按照real-time PCR说明书，配置反应体系。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次，72 ℃终延伸2 min。数据以2-△△Ct法进行分析。

1.2.4 MTS实验检测细胞增殖：取处于对数期的HT29和CD151-HT29细胞，消化离心后，以每孔2×103个细胞铺入96孔中，待细胞贴壁后，分别检测0，24，48，72和96 h的吸光度值。

1.2.5 平板集落检测细胞集落形成：取处于对数期的HT29和CD151-HT29细胞，消化离心后，以每孔1×103个细胞铺入6孔板中，5 d后对细胞进行甲醇固定5 min，结晶紫染色5 min，观察细胞数目。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭：取处于对数期的HT29和CD151-HT29细胞，以每孔3×105个细胞接种于Transwell小室内，待72 h后将小室固定于甲醇内5 min，结晶紫染色5 min。置于显微镜下观察，细胞穿过Transwell小室数目。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HT29和CD151-HT29细胞中CD151表达情况

CD151-HT29细胞组中的CD151的 mRNA表达水平和蛋白表达水平较对照组细胞明显降低(P<0.05)(图1)。

A.CD151 mRNA expression of HT29 and CD151-HT29; B.CD151 protenin expression of HT29 and CD151-HT29; C.relative absorbance value of fig B; *P<0.001 compared with normal control group

2.2 HT29和CD151-HT29细胞的增殖以及平板克隆形成情况

2.2.1 MTS实验：CD151-HT29细胞的增殖能力较对照组细胞明显减弱(P<0.05)(图2)。

*P<0.001 compared with control group图2 HT29和CD151-HT29细胞的增殖情况Fig 2 Proliferation of HT29 and CD151-HT29 cells

2.2.2 平板集落形成实验：克隆实验5 d后，CD151-HT29细胞数目较对照组细胞明显减少(P<0.05)(图3)。

A.colony formation of HT29 and CD151-HT29 cells(×4); B.statistical chart of HT29 and CD151-HT29 cells; *P<0.01 compared with control group

2.3 HT29和CD151-HT29细胞的侵袭情况

将Transwell小室置于显微镜下观察， CD151-HT29组穿过小室膜的细胞较对照组细胞明显减少(P<0.05)(图4)。

A.invasion activity of HT29 and CD151-HT29 cells(×10); B.statistical chart of HT29 and CD151-HT29 cells;*P<0.001 compared with control group

2.4 HT29和CD151-HT29细胞中CD151、LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表达情况

CD151-HT29细胞组中的CD151、LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表达强度较对照组细胞明显降低(P<0.05)(图5)。

*P<0.01 compared with control group图5 HT29和CD151-HT29细胞中LRG-1、LGR-5以及β-catenin蛋白表达情况Fig 5 Expression of LRG-1, LGR-5 and β-catenin in HT29 and CD151-HT29 n=3)

3 讨论

CD151是四跨膜蛋白超家族中的一员，是一个蛋白编码基因，其与遗传性皮肤病及流感等疾病相关[7]。此外，CD151还参与了细胞黏附等过程，可增强癌细胞的侵袭及迁移能力，在细胞的发育、增殖及运动中发挥着重要作用[8-10]。并且，CD151能够促进肾细胞癌的进展[11]， CD151过表达在乳腺癌或胃癌患者中是显著的，CD151过表达与人类某些实体瘤的较差存活相关[12]。也有多篇相关研究通过免疫组化表明，CD151在结直肠癌中呈高表达，并与预后相关，然而关于CD151在结直肠癌中发挥的功能还未明确。

因此，作者采用了CD151基因稳定低表达的慢病毒(sh-CD151)，感染结直肠癌细胞系HT29，通过Western blot技术以及实时定量荧光PCR技术，表明感染CD151低表达病毒后， HT29细胞的CD151表达被明显抑制。紧接着MTS增殖实验以及平板集落形成实验结果显示，CD151-HT29组细胞的增殖能力以及克隆形成能力明显低于对照HT29细胞组，上述结果表明抑制CD151的表达能够明显抑制癌细胞的增殖能力。此外，作者还通过Transwell小室实验表明，抑制CD151的表达能够明显抑制癌细胞的侵袭能力。然而关于CD151是如何对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭产生作用还不清楚。

CD151能够影响Wnt/β-catenin信号通路中起始蛋白的表达，并且β-catenin蛋白能够影响结直肠癌的增殖、迁移及血管增生等过程[13]，在结直肠的发生发展中起着重要的作用。然而在结直肠癌中，关于CD151是否能够调控β-catenin蛋白的表达却未有报道。

作者通过蛋白印迹实验表明，稳定敲低CD151后，Wnt信号通路起始蛋白LRG-1和LGR-5的表达明显减弱，此外β-catenin蛋白的表达也明显减弱。由此，作者得知，CD151确实可以影响β-catenin蛋白的表达。

本研究明确了CD151在结直肠癌中的促癌功能，有助于揭示CD151的促癌分子机制，补充了CD151在结直肠癌中的相关背景知识，进一步表明CD151可能是一个有价值的预后生物标志物或实体瘤的潜在治疗靶点。为未来结直肠癌的治疗提供了一定的理论基础。