糖尿病肾病进展的生物学标记研究进展

王子宜 戴恩来

730030兰州，甘肃中医药大学

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症之一。较早期的临床流行病学报道，约25%～40%的1型糖尿病患者以及5%～40%的2型糖尿病患者会发生肾损害和慢性肾病[1]。1型糖尿病诊断5～10年后，约20%～30%的患者出现微量白蛋白尿。20%的2型糖尿病患者在初次就诊即存在微量白蛋白尿。糖尿病进展至DN后，心血管疾病发病风险和死亡风险明显增加。在发达国家，DN已经成为肾替代治疗(renal replacement therapy，RRT)的主要原因[2]。据世界卫生组织报道，全球范围内，目前糖尿病患病人数约1.71亿，在未来的20年里，这一群体将成为发展中国家的主要疾病。据估计，到2030年，全球2型糖尿病患者将达到3.66亿[3]。近年来，尽管DN的治疗方法发生了革命性的变化，尤其是大剂量血管紧张素转化酶抑制剂和(或)血管紧张素受体抑制剂的应用，有效地延缓了DN的进展。但是，即使综合治疗达标、控制目前已知的糖尿病的危险因素并未能降低终末期肾病(end-stage renal disense，ESRD)的新发生率、心血管事件以及心血管死亡率[4]。

事实上，DN存在明显的异质性及家族聚集性，尽管糖尿病发病群体很大，但是，DN并不发生于所有的糖尿病患者，也并非所有DN都会过渡到ESRD。就1型糖尿病而言，诊断20～30年后，4%～17%发展为ESRD[5]。从临床表型来看，DN存在着两种类型：非进展型和进展型。这种不同的表型背后一定蕴藏着DN发病的本质。生物标记物可从分子水平探讨发病机制，准确、敏感地评价疾病的进展，从而为临床医生提供精准诊疗指导。

一、临床常用于DN进展的标记物

目前，临床上对DN进展的判断仍然取决于传统的标记物，如估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、肌酐、血尿素氮、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)和尿白蛋白/肌酐比率(urinary albumin creatinine ratio，ACR)等。eGFR作为常用的评价肾功能的指标，只反映疾病的结果，并不能预测早期肾脏结构的改变，而且很多因素会影响其水平，不能为疾病进展提供预警。微量白蛋白尿和ACR常用作DN早期诊断的标志物，也被认为是预测DN进展的指标[6]。但是，研究发现，部分无白蛋白尿患者也会演变为DN，部分患者表现进行性肾功能减退先于微量白蛋白尿，部分微量白蛋白尿的患者经合理的综合控制可得以逆转。因此，有学者认为，微量白蛋白尿并不代表持续的肾损害过程。在持续白蛋白尿存在的情况下，广泛的肾小球损害已经出现。因此，尿白蛋白水平可能不一定与DN的进展同步，而是代表一个初始的肾损害的可逆期，为DN进展提供预警还有缺陷[7-8]。

尿非白蛋白类蛋白(urinary non-albumin protein，uNAPs)被认为是肾小管损伤的有用标志物[9]。这些蛋白包括α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、IgG、胱抑素C、转铁蛋白、肾素、基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制剂-1。它们可能和微量白蛋白尿同时出现，也可能出现在微量白蛋白尿之前。有学者观察了2型DN患者uNAPs/肌酐比值，发现uNAPs/肌酐比值与eGFR的年下降率密切相关，可预测慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)3期或向更晚期DN的进展，可能是2型DN早期阶段疾病进展的指标和诊断工具[10-11]。从这些研究来看，尿非白蛋白类蛋白的检测可作为DN肾损伤的指标，并不能为疾病进展提供预警，uNAPs/肌酐比值可能是预测疾病进展的指标，还需要大样本多中心的临床验证。

二、与肾脏结构和功能损伤相关的生物标记物

至今为止，临床上尚缺乏特异、简便的判断DN进展为ESRD的标志物。Mottl等[12]报道了109例糖尿病性肾小球硬化症肾组织学变化对终末期肾衰的预后价值，他们发现节段性硬化和毛细血管外高度细胞增生是DN向终末期肾衰进展的标志。但是，样本量太少，还需要大型多中心研究的验证。另外，现阶段对糖尿病患者进行常规肾活检还有难度。大量蛋白尿是糖尿病患者进展为ESRD的危险因素。有报道，糖尿病患者出现肾病范围的蛋白尿往往伴有肾功能的快速减退，肾脏病理则表现为弥漫性肾小球病变和小管间质病变。因此，糖尿病患者出现中、大量蛋白尿可能预示着疾病的进展。另外，部分以小管间质损害为主的DN患者并没有出现临床蛋白尿却发展为ESRD[13]。因此，仅仅以白蛋白尿作为DN的标志尚有缺陷。

最近，一种基于毛细管电泳质谱的蛋白质组学方法被用于尿肽分类，即CKD273，该分类法能预测肾小球滤过率的快速下降(即eGFR每年下降5%以上)和大量白蛋白尿的发生。在DN早期患者研究发现，高危组CKD273评分持续微量蛋白尿累计发生率明显高于低危组，对进展型的DN患者可提前5年预测微量或大量白蛋白尿发生，尤其对于蛋白尿阴性的DN更有预测价值，CKD273分类评分被认为是2型糖尿病患者出现微量蛋白尿的独立预测因素[14-15]。但是，新近研究却得出不同的结论，在2型糖尿病和微量白蛋白尿DN患者长达19年的随访中，CKD273评分并未能显示其对肾脏终点事件的预测价值[16]。DN具有明显异质性的特点，不同疾病阶段尿蛋白组学可能有不同的变化，早期的系列研究主要集中在DN白蛋白尿阶段，Oellgaard等的随机化研究随访长达19年，虽然没有显示CKD273在疾病进展预测上的优势。但是尿肽分析依然是寻求疾病进展标志物的方向。因此，进一步的研究应考虑DN不同的表型、疾病的不同阶段以及CKD273亚型。

Kaburagi等[17]应用液相色谱和质谱的二维图像转换分析集成平台对2型糖尿病和(或)DN患者进行了尿蛋白质谱定量分析发现，一种人维生素E结合糖蛋白Afamin、甲胎球蛋白、CD44抗原和溶酶体相关膜糖蛋白2与ACR、eGFR显著相关，eGFR<60 mL/min组尿afamin水平明显高于eGFR>60 mL/min组。研究对尿afamin水平和肌酐比值(Afa/Cre)进行对比分析发现，发现进展到更严重DN期的患者尿Afa/Cre明显高于未进展到DN期的患者。这些研究表明，尿Afa/Cre可能对DN进展具有预测价值，但是该研究病例数尚少，需要进一步的临床验证。

足细胞在维持肾小球滤过屏障中起着关键性的作用。足细胞凋亡，缺失参与了DN的发病机制。甘氨聚糖-5(Glypican-5，Gpc5)是肝素依赖生长因子和黏附因子活化的共受体或调节剂，主要表达在足细胞，具有强化碱性成纤维细胞生长因子-2信号转导，影响足细胞的分化和功能，从而影响白蛋白的通透性。DN患者尿Gpc5水平明显高于糖尿病和正常对照。在37例DN患者长达52周的随访中，DN患者尿Gpc5水平与24 h尿蛋白、UAE增加相关、与eGFR下降显著相关，而且eGFR显著下降独立于24 h尿蛋白和UAE[18]。足细胞作为肾小球重要的滤过屏障，Gpc5作为足细胞结构和功能的重要调节者，DN患者中Gpc5特异性升高，可能是DN进展的一种有用的非侵入性标记物。

临床上，DN的筛查常以UAE或eGFR为基础，主要反映肾小球损害。然而，肾小管损伤在DN的发生、发展中也发挥了重要作用。因此，对小管间质损伤的标志物的研究具有重要的临床价值。肝型脂肪酸结合蛋白(liver-type fatty acid-binding protein，FABP)、中性粒细胞明胶酶相关脂碱(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、肾急性损伤分子(kidney injury molecule-1，KIM-1)等被认为是急性肾损伤早期敏感而准确的标记物，也是CKD的生物学标志。现有研究发现，尿FABP升高可出现在DN肾小球损伤或白蛋白尿出现之前，而明显升高则出现在eGFR下降阶段，尿FABP与eGFR下降相关。尿液高水平的NGAL与合并微量白蛋白尿或大量白蛋白尿的2型DN的GFR下降密切相关，尿FABP和NGAL可能是疾病进展的预测指标[19-20]。从这些结果看，FABP和NGAL在判断DN进展方面有很好的前景，但是还需进一步大样本、多中心、前瞻性队列研究的进一步验证。

KIM-1被认为是小管间质损伤的标志。越来越多的研究表明，肾小管间质损伤在DN发病机制和疾病进展中具有重要作用，而且小管间质损害的炎症程度和DN肾脏预后有密切的关系。现有研究发现，DN患者血、尿KIM-1水平随着白蛋白尿的增加而增加，随着尿白蛋白的减少而减弱。随着糖尿病病程的延长，血、尿KIM-1水平逐渐升高，且与eGFR之间存在负相关关系，在使用肾素血管紧张素系统(renin angiotension renin system，RAS)阻断剂的患者，随着血压和UAE水平的下降，尿KIM-1的水平也有所下调。在DN患者，肾组织KIM-1表达明显增加，而且其水平和eGFR下降密切相关[21-23]。因此，有学者认为血、尿KIM-1水平可能成为DN进展的无创性生物标志物。然而，孟德尔随机化研究得出了相反的结果。研究通过对DN患者KIM-1基因多态性、结合GWAS大数据分析发现，尿KIM-1不能独立于尿UAE或eGFR预测DN的进展[24]。孟德尔研究设计，遵循“亲代等位基因随机分配给子代”的孟德尔遗传规律，使用基因型作为工具变量来推断表型与疾病之间的关系更符合遗传背景复杂的疾病的研究。由于DN异质性及复杂的病理生理，尽管KIM-1、尿白蛋白排泄率和eGFR之间存在一种复杂的关系，但是，KIM-1并不能预测DN的进展。综合这些研究来看，有关KIM-1预测DN进展的研究，并没有考虑DN的遗传因素，结合DN的异质性特点，考虑影响生物标记物的遗传因素可能是很重要的。在目前情况下，尿KIM-1还是一种DN小管间质损伤的良好的诊断指标。

三、与代谢相关的生物标志物

糖尿病存在过氧化应激状态，氧化应激导致内皮细胞功能障碍，炎症细胞聚集，细胞增殖、细胞外基质的合成。因此，氧化应激产物可能是反映DN进展的良好指标。

尿酸可诱导氧化应激，促进内皮功能障碍，刺激RAS活化，引发炎症的级联反应，尿酸与慢性肾脏疾病的关系日益受到人们的重视，有学者对微量白蛋白尿阳性且eGFR基线值>60 mL·min-1·(1.73 m2)-1的I型糖尿病患者355例进行了为期6年的随访，终点事件为eGFR下降>3.3%/年，结果显示，eGFR下降大于3.3%/年的患者年龄较大，病程较长[25]。随着血清尿酸的增加，eGFR快速下降的风险明显增加，而且血清尿酸水平可预测CKD 2期向3期进展的风险，而并不预测尿白蛋白/肌酐的变化。Chang等[26]将2 367例2型糖尿病患者分为稳定期、进展期和恢复期，随访3年以上，多因素Cox回归分析发现，进展组基线血清尿酸最高，恢复组的尿酸水平最低，血清尿酸水平>6.3 mg/dL是CKD进展的独立危险因素。脂联素是一种胰岛素增敏激素，对于能量代谢具有重要的调节作用，是人体对抗胰岛素抵抗、血管功能异常、动脉粥样硬化等的保护性激素。Panduru等[27]观察2 090例1型糖尿病患者尿脂联素的变化，进行随访4.4～6.9年，Cox回归和竞争风险模型评价显示，尿脂联素是DN发展为ESRD进展的独立预测因子，尿脂联素与eGFR联合应用更能增加预测的效果。从这些研究看，尿酸和脂联素可能是预测DN进展有前景的指标。

四、与炎症相关的生物标记物

越来越多的证据也表明，DN存在明显的炎症过程。综合目前研究，众多炎症因子如TNF-α、MCP-1、TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-8参与了肾脏炎症和损伤过程[28-29]，但是这些因子是否可作为DN进展的预测因子尚在临床观察中。尿巨噬细胞趋化蛋白-1(macrophage chemoattractant protein-1，MCP-1)水平与肾小管间质白细胞浸润程度相关，它的水平可预测狼疮性肾炎的不良结局。DN患者尿液MCP-1水平和肾组织表达均有增加。在1型糖尿病患者发现，高水平尿MCP-1水平与糖尿病早期eGFR的下降有关，也与肾间质炎症和水肿相关。有学者随访了83例2型DN患者23个月发现，基线尿MCP-1、ACR高而尿EGF水平、EGF/MCP-1比率下降的患者eGFR出现明显下降。多因素分析显示，尿MCP-1、EGF/MCP-1与肾功能的下降密切相关，是肾功能进展的独立预测因素[30]。从这些研究来看，尿MCP-1、EGF和EGF/MCP-1在DN进展的预测方面有很好的前景。但也应该注意到，这一研究为单中心研究，样本量少、随访时间不够长，还需要大样本多中心研究的验证。有研究发现，合并肾损害的糖尿病患者血、尿IL-6水平明显高于无肾损害者，且肾活检组织IL-6 mRNA表达明显增加，随着疾病的进展，其表达增加，高水平的血清IL-6还与肾小球基底膜增厚相关。在STZ模型鼠中，IL-6 mRNA在肾组织中呈高水平表达，同时尿IL-6水平升高且与UAE密切相关。IL-6可通过改变内皮通透性、诱导系膜细胞增殖和ECM积聚以及基底膜增厚[31-32]。从这些研究看，IL-6可能与2型DN进展相关，IL-6的监测可能有助于评价不同阶段DN肾损伤的程度。

高糖可诱导巨噬细胞、小管细胞和系膜细胞产生TNF-α而促进炎症反应。TNF-α尚可诱导内皮细胞、系膜细胞和小管细胞凋亡和ECM积聚进而影响肾小球的滤过、小管的通透性和重吸收。临床研究发现，糖尿病肾功能不全的患者血和尿TNF-α水平异常增高，同时DN患者循环中TNF-α受体1和TNF-α受体2水平明显升高，与eGFR下降密切相关并独立于白蛋白尿状态，评估血清、尿中TNF-α或其受体水平可预测DN向ESRD的进展，尤其TNF-α受体1的水平更有预测性[33-34]。这些研究表明，TNF-α受体1在DN进展的预测方面可能有很好的前景。

TGF-β、CTGF、VEGF等生长因子是参与肾脏结构重组的重要的因子。研究发现，TGF-β、CTGF、VEGF与微量白蛋白尿、eGFR水平下降密切相关。在2型DN进展阶段血浆VEGF常增高，在大量白蛋白尿的DN患者尿CTGF水平明显升高[35]，这些生长因子作为参与肾脏纤维化因子复杂网络的成员，其预测DN进展的价值尚需要进一步研究。新近研究还发现，成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor-21，FGF21)与DN的进展有关，FGF21是FGF家族的一员，它是糖和脂代谢的重要调节因子，高水平的FGF21与异常代谢、炎症、合并症和死亡率相关。研究发现DN患者血清FGF21水平和尿白蛋白排泄有密切关系，从正常白蛋白尿向微量白蛋白尿的过渡，从微量白蛋白尿到大量白蛋白尿过渡甚至出现肾功能障碍，血清FGF21均出现明显的变化。这些研究表明，FGF21与DN发生、发展密切相关，是2型DN肾功能恶化的独立预测因子，并且可能是预后不良的生物标志物[25-28]。然而，来自db/db糖尿病模型鼠的研究发现，重组的FGF21干预能显著降低db/db小鼠蛋白尿、系膜基质扩张、细胞因子产生，改善肾脂质代谢和氧化应激损伤[36]。这些研究结果提示FGF21可能在不同疾病阶段有不同的作用，进一步的前瞻性队列研究对其预测疾病进展的价值是必要的。

五、microRNAs与DN进展

microRNAs(miRNAs)是近来发现的一类调节基因表达的非编码RNA，长度为20～22 bp。miRNAs的靶基因与炎症、纤维化和氧化应激相关。血清循环miRNA是存在于细胞外miRNAs的特殊存在方式，同时由于其在血循环中的稳定性且易于监测已成为新的的DN的诊断生物标志物。尽管miRNAs与DN的关系有很多报道。但是，他们中大多数在DN发病机制中的作用和临床价值尚在探索中。

1.与DN进展或非进展相关的miRNAs 研究发现，在无白蛋白尿的糖尿病患者、正常白蛋白尿的DN患者循环miR-126水平降低，在中重度白蛋白尿DN患者则更低。进一步分析发现，miR-126与尿白蛋白排泄量呈负相关，与GFR呈正相关。同样的研究发现，无DN的糖尿病患者尿液中miR-10、miR-23、miR-30和miR-200的表达明显增高，这提示miR-126、10、23、30、200可能是肾损害的保护因子，可能对非进展型DN具有预测价值[37]。Pezzolesi等[38]对I型糖尿病进行了720年的随访，对临床表现为进展或非进展的两组进行分析，发现循环miR-let-7c-5p和miR-29a-3p是保护性因子，预示疾病的稳定，而循环miR let-7b-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p和miR-let-7c-5pK增高则预示着DN向ESRD进展预测因子。从这些研究来看，miRNAs可能是判断DN进展与否有很好前景的指标，但是，目前这些研究多为单中心研究，病例样本量相对较少，多中心大样本前瞻队列研究仍然是必要的。

2.与DN炎症相关的miRNAs 许多研究报告了miRNAs与炎症的关系，有学者观察miR-29能诱导大鼠肾小球IL-6和TNFα的表达。也有学者发现miR-217可诱导大鼠肾小球系膜TGF-β1、内皮素和纤维连接蛋白的产生。miR-192可诱导大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1的表达，而miR-26A、miR-30C和miR-93与大鼠系膜细胞TGF-β1表达降低相关[37，39-40]。研究提示，这些miRNAs在DN的进展中发挥了重要作用，监测这些miRNAs可能对炎症过程明显的进展型DN具有预测价值。

3.与DN肾组织纤维化相关的miRNAs miR-21是DN大鼠肾组织表达最多的miRNAs，体内、外研究发现，抑制miR-21可减少系膜基质扩张，间质纤维化，巨噬细胞浸润、足细胞丢失、蛋白尿和炎症和纤维化分子的表达[41]。有学者发现高糖能诱导体外培养的糖尿病大鼠肾小球系膜细胞miR-27a的表达，而抑制miR-27a则抑制系膜细胞的增殖、降低细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的表达。临床研究发现，DN患者循环miR-130b水平显著降低，miR-130b水平与血清肌酐、β2微球蛋白和蛋白尿呈负相关。抑制miR-130b会增加体外高糖介质培养的小管细胞snail的表达，后者与胶原IV的表达密切相关。这些研究表明，miR-130b可能在肾纤维化中发挥了重要作用。新近研究发现，在STZ和db/db小鼠，TGF_β1信号可上调系膜细胞和肾小球miR-192的表达,后者可上调ECM和纤维化的效应基因，促进胶原蛋白2和胶原蛋白4a以及其他miRNAs的表达，进一步放大TGF-β信号及其纤维化效应[42-43]。这些研究结果提示，这些miRNAs在DN发生和发展中发挥了重要的作用，临床对它们的监测可能是预测DN进展的重要指标。

4.与肾素-血管紧张素系统(RAS)相关的miRNAs RAS抑制剂在DN的治疗中发挥了重要的作用。有研究发现，氯沙坦可抑制糖尿病大鼠肾组织miR-503和miR-181d的表达，从而降低白蛋白尿和肾脏损伤。另有研究也发现，在某些合并肾纤维化的DN患者中，miR-142-3p、miR-223-3p、miR-21-5p、miR-142-5p、miR-214-3p高表达，miR-29c-3p和miR-200a-3p低表达[37，44]。这些研究提示，这些miRNAs与DN进展、肾小球硬化有密切关系，miRNAs可能是判断DN进展的重要标志。

5.与长链非编码RNA相关的miRNAs 近年来，许多研究显示长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)与表观遗传、基因表达调控和疾病发生有非常密切的关系，lncRNAs虽然不编码蛋白质，但是很多lncRNAs充当着功能性RNA分子。lncRNAs在体液中高度稳定且易于检测的特点有望成为DN进展的标记物。

浆细胞瘤变异体1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)是一类长约1.9 kb的lncRNA，定位于人染色体8q24区域，位于ESRD的潜在位点，可能是2型糖尿病肾病ESRD的候选基因。Hanson等[45]对105名无血缘关系的无大量白蛋白尿病史十年以上的2型糖尿病进行了115352个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的全基因组分析发现在8q24上有200 kb的区域，其中包含3个SNP，在对照组和患者之间等位基因频率存在显著差异。这些SNP正位于PVT1基因区域。PVT1可能是糖尿病进展为ESRD易感的易感基因。PVT1可在多种细胞肾脏细胞表达。研究发现，PVT1可介导TGF_β1信号促进系膜细胞中ECM的积累，而PVT1基因敲除可显著降低人类系膜细胞ECM和胶原IV蛋白和基因表达，同时下调两个关键ECM调节因子TGF-β1和纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表达。新近研究发现，PVT1至少产生6个miRNA，包括miR-1204、miR-1205、miR-1206、miR-1207-5P、miR-1207-3P和miR-1208。源于PVT1基因的miR-1207-5p可增加TGF-β1的表达和PAI-1的表达。在miR-1207-5p基因敲除后，系膜细胞TGF-β1、PAI-1和FN蛋白表达明显减少[46]。这些结果提示了PVT1衍生的6个miRNAs可能在DN进展方面有重要的作用。临床上对它们的研究可能对揭示DN发病机制和预测DN进展具有重要意义。

六、展望

以上所述DN进展标记物的研究还有很多，目前大多数尚在研究阶段。随着人们对DN发病机制认识的不断深入，更广泛的基因组学、蛋白质组学和代谢组学的应用以及未来更大规模、多中心、前瞻队列临床研究的开展，进一步阐明这些可能的标记物在DN进展中的作用和分子机制，以确定他们的临床应用价值，实现这些候选的分子标记物从理论到临床实践的转变，对科学实施DN的精准管理是十分重要的，同时这些标记物可能作为DN治疗靶点，为进一步的新药开发提供理论基础。