CircRNA在妇科肿瘤中的研究进展

郝辰珺 李智 陈彦竹 梁伟国 李艳秋★ 黄超友

近年来，随着分子生物学技术在临床疾病诊断和生物制品的研发需求的不断加深，研究者对肿瘤的作用机理、细胞层面、分子水平的变化进行了深入挖掘。CircRNA 是一种非编码RNA，其发现改变了传统的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）在机体蛋白编码的认知观点[1]。CircRNA与传统的mRNA 最大的区别在于其存在的闭环可抵抗RNA 酶的降解，这个闭环是由RNA 分子的3′和5′端的磷酸基团共价偶联而成，从而保障了CircRNA分子的稳定性和进化保护[2]。随着CircRNA分子在不同生物体中不断发现，研究者对其进行了相应的信息网络构建，截止目前国际上已经完成了近20万种不同CircRNA的信息库，由此进一步证明CircRNA 是生物界广泛存在的，但是由于CircRNA分子的发现较晚导致目前其对各种细胞的作用机理及作用途径了解较少。通过CircRNA分子的生物学特征及分类研究发现，CircRNA分子广泛参与蛋白质的翻译和表达，同时其还具有miRNA 海绵分子功能以及RNA 连接蛋白（RNA banding protein，RBP）功能[3]。同时大量研究发现，CircRNA 参与了表观遗传学的调控，对生殖干细胞定向发育以及胚胎的成熟均起到重要影响[4]。在疾病诊断上目前大量研究证实CircRNA 可以与miRNA 产生复杂的相互作用从而影响肿瘤细胞的发育、转移及凋亡等[5]。本研究以CircRNA在妇科肿瘤中的变化为研究思路，综合国内外研究报道，深入总结CircRNA的生物学特征以及其对妇科肿瘤的发生及在诊断中的价值。

1 CircRNA的概述

1.1 CircRNA 简介

CircRNA是RNA家族中发现的最新成员，属于非编码RNA，其主要存在于转录的拼接过程中，由单链RNA的3′和5′通过共价键连接形成稳定的环状结构，此环状共价环有效保障了CircRNA对RNA 核酸外切酶高度耐受性特性，因此相比线性RNA 更具有稳定性。

1.2 CircRNA的来源

CircRNA主要来自于蛋白质编码基因，目前已经在于人类基因转录产物、病毒及细菌中[6]。CircRNA 是tRNA和lncRNA 之间的基因间隔子或反转录本，其不含有线性RNA的5′和3′ 的poly（A）结构。根据其RNA 序列的来源不同将其分为外显子CircRNA（ecRNA）、内含子CircRNA（ciRNA）和外显子-内含子CircRNA 3种，其中外显子CircRNA 占比最高。除外显子CircRNA 存在于细胞质中外，其余两种均存在于细胞核中，3种CircRNA在细胞中的结合位点均为2′-5′磷酸二酯键[7]。外显子CircRNA 除具有miRNA 海绵作用外，还起到RNA 连接蛋白RBP 作用，以调控RNA的选择性拼接、运输及翻译，从而调控细胞增殖、分化及凋亡等生理过程，内含子CircRNA和外显子-内含子CircRNA 主要参与调整基因转录过程[8]。

1.3 CircRNA的特征及生物学功能

CircRNA 是近年来新发现的非编码RNA，研究者对其生物学特征的研究主要通过与线性RNA 对比而获得，目前对CircRNA的分子学特征总结主要包括：①CircRNA 主要产生于外显子，且主要在细胞质中表达，少量参与细胞核中表达的主要为内含子CircRNA 或其片段；②外显子CircRNA 可参与内生非编码RNA的表达调控，其对RNA 转录前后的变化起到重要调节作用；③CircRNA 可以与miRNA 相互作用从而调节目标蛋白表达；④CircRNA 具有对RNA 核酸外切酶高度耐受的共价闭环，从而保障了其结构功能的稳定性，这种性质对物种进化过程中起到重要保护作用，这种保护作用间接决定了组织特异性；⑤CircRNA 通常被发现存在于细胞外液（唾液、血液及尿液等）中，且其表达水平是线性RNA的十倍以上[9-11]。CircRNA的上述特征保障了其具有稳定的生物学特征，因此有研究发现多数物种中的CircRNA的半衰期比线性RNA 长近10 h 左右。

基于CircRNA的分子特征，研究者发现了CircRNA 许多潜在的生物学功能，主要包括：①CircRNA 起到miRNA 海绵分子功能。Hansen等[12-13]研究发现CircRNA 含有多个可以与miRNA-138 连接的位点，同时有研究也进一步证实了小脑变异蛋白（CDR1）的反义链CircRNA（CDR1as/CiRS-7）存在人和鼠的脑组织中，CiRS-7（circular RNA sponge for miR-7）含有73个miR-7 结合位点，当其与miR-7 结合后可以抑制miR-7 的生物学功能，从而激活miR-7 的下游基因。Thomas B H等[14]研究发现SRY-CircRNA（SRY-9）可以作为miR-138 的分子海绵，而SRY-9 是小鼠Y 染色体上决定性别的基因，因此生物体中CircRNA 作为miRNA的分子海绵可能性较为普遍。同时研究者们[15]还发现绝大多数CircRNA 均可作为miRNAs的分子海绵，就如miRNA 作为mRNA 一样。②CircRNA 起到RBP 功能，RBP 主要通过对RNA转录后调控影响细胞代谢过程（细胞增殖、分化、凋亡及衰老等），如RNA 连接蛋白circ-Foxo3 可通过与细胞蛋白依赖性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinases，CKD2）相互作用以抑制细胞周期维持在G1/S 阶段[16]。由CircRNA 海绵分子通过与精氨酸蛋白（AGOP）、RNA-QKI MBL 蛋白、RNA 聚合酶Ⅱ（polⅡ）及真核启动子4A-Ⅲ组成的RNA 蛋白复合体（RNA- protein complexes，RPCs）起到了RBP 作用，并可以与线性RNAs 结合发挥转录后调控功能[17]。但是，目前对CircRNA 连接蛋白调控RNA 转录机理尚不清楚，但是可以初步确认cricRNA 调控基因转录过程主要发生于细胞核中，而其起到RNA 海绵分子作用主要发生在细胞质中。③CircRNA 可参与蛋白编码过程。CircRNA 属于非编码RNA的一条链，当其被插入到细胞内核糖体结合位点（IRES）时，就会产生与线性RNA 不同的蛋白编码转录，之后真核细胞核糖体中40s 亚基与含有IRES 的CircRNA 发生病翻译[18]。截止目前仅发现病毒CircRNA 具备这种可编码翻译蛋白的功能，如HBV 的卫星病毒HDV，同时这种病毒CircRNA在真核细胞中的翻译机理尚不清楚[19]。④CircRNA 协同miRNA 参与机体不同器官细胞的生理功能调节。Chen 等[20]研究中发现进行体外受精治疗期间，CircRNA水平（circ103827，circ104816）与女性高质量胚胎数呈现负相关，Dong 等[21]研究发现CircRNA水平与精子的运动及受精也具有相关性。除上述生物学功能外，CircRNA水平也与相关疾病有一定相关性，Zhang 等[22]发现CircRNA101222 表达水平在子癫前期（PE）女性与正常女性之间存在显著差异。同时，Qian等[23]发现PE女性和早产女性胎盘组织中有3种CircRNA 表达水平存在显著差异。

1.4 CircRNA在肿瘤发生中的作用机理

随着CircRNA的深入研究，研究者发现CircRNA的水平变化不仅对机体相关生理功能调节作用，同样对肿瘤的发生及起到重要影响。大量的研究证实了CircRNA可参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及凋亡。Ma 等[24]研究发现CircRNA-000284 可以与miR-506 作用调节宫颈癌细胞的增殖及侵袭，Xing 等[25]发现CircRNA 可通过调节AKT/mTOR 信号路径影响肿瘤细胞增殖及转移。Liu 等[26]发现Circ-ZFR 可以通过调节PTEN和mir-130a/mir-107 促进肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞扩增，Wang 等[27]发现has-Circ-0014717 可以通过调节p16 的表达影响肿瘤细胞周期。综合近年来研究可知，CircRNA 主要通过调节肿瘤细胞生长过程中相关信号通路途径调节促进和抑制肿瘤的变化，但是其如何作用信号通路中特定蛋白的机理目前仍需要深入研究。

1.5 CircRNA的临床检测

随着近年来深入研究，研究者发现CircRNA 是一种普遍存在nRNA，其参与细胞中各种不同基因的表达调控，但是目前对其的研究较少且其潜在的一些功能仍未被揭露。传统的CircRNA 检测主要通过CircSeq 技术，这种方法对于低丰度CircRNA的检测有效率较低，同时对区别反向剪接产生的CircRNA和细胞中本身存在的CircRNA 功能较差，随着生物学信息技术的不断改进高通量测序技术有效的改善了RNA-seq 上述缺陷。基于高通量测序方法，目前CircRNA的测序工具也相应增多如Mapsplice、CIRI 及CIRCexporer 等。除此之外，为便于有效探知CircRNA的功能，目前全球已建立了关于CircRNA的基因组和序列数据库（如www.circbase.org）中包含了150 000个CircRNA的信息[28]。

2 CircRNA在妇科肿瘤疾病的相关性研究进展

妇科肿瘤是目前妇科疾病中对女性健康危害性最大的一类疾病。妇科肿瘤种类较多，包括宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌等，据报道，宫颈癌和卵巢癌的致死率及发病率最高。

2.1 CircRNA与宫颈癌

Abdelmohsen 等[3]通过使用宫颈癌HeLa细胞研究证明CircPABPN1 可以竞争性的连接到HuR上，这样就可以抑制HuR′s 的连接位点连接到PABPN1 mRNA 上进行翻译，从而抑制肿瘤细胞扩增。Bachmayr-Heyda 等[29]发现在13种人类组织中CircRNA的整体峰度与肿瘤细胞增值率呈现负相关。除此之外，有研究发现，CDRIas 在宫颈癌组织中的表达水平远高于癌旁组织，而miR-7与其相反[30]。Lee 等[31]通过对宫颈癌的Hela和C33A细胞研究发现，CDRIas 的超表达可以通过抑制miR-7 的活力而增加FAK（粘着斑激酶，miR-7 的靶标）的表达，FAK 的超表达可促进宫颈癌细胞的扩增、侵袭及迁移，此结果进一步证实CDRIas与miR-7 在宫颈癌的调节中具有相关性。因此建立基于CDR1as 的检测方法对宫颈癌的早期诊断具有重要作用，除此之外以CDR1as 进行分子靶标进行靶向治疗潜力巨大。

2.2 CircRNA与卵巢癌

卵巢癌，目前妇科肿瘤中致死率最高的疾病，其不仅影响卵巢部位卵母细胞的正常发育，同时对卵巢激素分泌也造成很大影响。Zhou 等[32]研究发现，当mRNA 上调或CircRNA 下调时，与其相关的NFkB、PI3k/AKT和TGF（这两个含有多种miR-24/let-7 结合位点）就会在转移癌中被上调。此结果说明CircRNA与mRNA在卵巢癌的发生中具有相关性，并且可以通过与卵巢细胞上miR-24/let-7结合位点结合竞争性抑制miRNA的线性剪切和海绵功能，调节转移-诱发基因的表达，从而有利于卵巢癌的转移。因此以NFkB、PI3k/AKT和TGF作为靶点既可以对卵巢癌的发生及进展的监测具有重要的指导作用。

2.3 CircRNA与乳腺癌

乳腺癌同样是困扰女性健康的重要疾病。有研究发现CDR1as可以起到的miR-7的海绵分子作用，从而可以反向调节miR-7 活性并降低其对ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，从而反过来促进包括乳腺癌在内的肿瘤的发展，当miR-671 连接到CDR1as 上，由AGO介导的分裂就会被启动从而降低CDR1as 的表达水平，从而减弱CDR1as 的表达，间接调整miR-7的活性水平[33]。miR-7 的表达水平主要被其上游基因HOXD10 正向调节，其低表达水平可以提升癌症的侵袭性能，当PAK1 水平上升、miR-7 或HOXD10 水平下降时，乳腺癌细胞的侵袭力就会增强[34]。发现miR-7 还可靶向REGγ 抑制乳腺癌小的扩增，同时可促进乳腺癌细胞凋亡[35]。因此，miR-7 的表达水平与癌症的上皮分化密切关联：表达水平越低，转移潜能越弱。

Karla 等[36]发现miR-7 可以抑制p21 激酶的表达（PAK1），这种酶在多种肿瘤中水平均呈现上调，同时有研究发现miR-7 在哺乳动物乳腺癌组织中低水平表达，且其表达水平与癌细胞的转移能力能负相关性。Tang 等[37]发现作为miR-7的海绵分子，CDR1as 可以反向调节其活性并降低其对ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，从而反过来促进乳腺癌的恶化。

2.4 CircRNA与子宫内膜癌

在其他妇科肿瘤研究中，Yang 等[38]发现Circ-ITCH可以竞争性的连接到miR-17和miR-224，从而影响p21和PTEN的不同表达，PTEN的突变或缺失可使其酶活性失活，然后PTEN失去抑制细胞增殖的能力，PTEN位于10 号染色体上，其可以参与磷酸酶和肌张力蛋白的表达，磷酸酶和肌张力蛋白同源物是一种具有磷酸酶活性的癌症抑制物，因为它可以抑制分裂、增殖、侵袭、迁移及并加速癌细胞的凋亡。因此，当PTEN的突变或缺失可使其酶活性失活，细胞倾向于恶性肿瘤，可能会引起子宫内膜癌。同时Chen 等[39]研究发现，正常人子宫内膜癌组织中CircRNAs 表达水平较低，因此CircRNAs 水平的变化对子宫内膜癌的发生具有一定的诊断价值。

3 CircRNA在妇科肿瘤疾病的诊疗中面临的挑战

综合上述研究分析可知，CircRNA已经越来越备受科学界所关注，其参与机体细胞分子生物学调控的机理也不断被揭露，然而这些研究都是处于初步研究阶段。CircRNA在生物体内广泛存在，但是各种潜在CircRNA分子信息库的构建目前还待完成，同时这些CircRNA在不同疾病的信号通路调控路径还需要进一步研究。通过对妇科肿瘤疾病相关CircRNA分子调控的近些年研究总结可知，CircRNA在妇科肿瘤疾病的诊断、病程发展判断和靶向分子治疗药物的研究具有重要指导意义。但是，在不同类型妇科肿瘤发生相关CircRNA 之间的关联性研究方面较少，仍需要进一步深入挖掘。同时，不同CircRNA在调节肿瘤的发生及抑制过程中角色研究目前还不清楚。特别是在癌症不同阶段，CircRNA分子之间、CircRNA分子与miRNA分子之间复杂协作机理的研究均是未来科学认知的挑战。

4 展望

妇科恶性肿瘤是妇科疾病中对患者伤害最大的疾病，目前对恶性肿瘤的治疗无特效的药物，主要通过早期诊断及早期治疗方式改善预后。为了有效提升早期诊断准确性，分子生物学诊断技术在妇科肿瘤疾病的诊疗中越来越收到关注。CircRNA 是非编码RNA家族后起之秀，越来越多的研究证实其在生物体中种类丰富多样，结构较为稳定，在细胞或组织中特定表达。因此，基于不同CircRNA分子建立调控网络，为后期妇科肿瘤在疾病预防及治疗药物的研发提供了重要的指导思路。除此之外，CircRNA分子在临床疾病诊断中新型快速检测技术的研发同样是未来发展的一种趋势。