青海省南部地区154株结核分枝杆菌临床分离株耐药性检测结果分析

蒋明霞 晁秀珍 王兆芬 马斌忠 马永成 王蓉 王朝才 李尔琛 魏於家 李咏雪 张琪

据2018年世界卫生组织报告， 2017年全球新发结核病患者估算约1000万例，耐多药和(或)单耐利福平结核病(MDR/RR-TB)患者56万例。中国新发结核病患者约90万例，MDR/RR-TB患者7.3万例[1]。耐药结核病的出现增大了治疗难度，全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国结核病患病率呈现西部高于中部、中部高于东部的特征，结核病总耐药率为36.8%，耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)占6.8%[2]。青海省平均海拔3000米以上，南部(以下简称“青南地区”)平均海拔超过4000米，面积占全省总面积的一半以上，气温偏低，以藏族、蒙古族为主要民族，以农、牧业为主。为掌握青南高寒地区结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)耐药类型及分布情况，为改进牧业区结核病防治措施提供依据，笔者对我省结核病参比实验室收集的154株MTB进行耐药性分析。

资料和方法

一、 菌株来源

1.菌株的选取：收集青南地区(玉树州、果洛州、黄南州)市/州级疾病预防控制中心结核病实验室2018—2019年全部518例病原学阳性患者的标本，进行分离培养，并对培养阳性菌株进行抗结核药物敏感性试验和菌种鉴定，最终经菌种鉴定的MTB菌株为154株。其中，玉树州44株、果洛州12株、黄南州98株；男性95株，女性59株；年龄分布在13～79岁之间，中位年龄27岁。

2.菌株分离：依据《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[3]，应用改良罗氏培养基进行痰分枝杆菌分离培养。痰标本采用4% NaOH去污染处理后直接接种至酸性罗氏固体培养基上，接种后第3天和第7天观察培养情况，然后每周观察1次，直到第8周末。

3.菌种鉴定：分离株在进行药物敏感性试验的同时，利用对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培养基生长试验初步鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，排除非结核分枝杆菌。

二、 研究方法

1.主要试剂：改良罗氏培养基、药物敏感性试验培养基、PNB培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司。

2.药物敏感性试验：药物敏感性试验操作参考《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[4]中的比例法，对异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、链霉素(streptomycin，Sm)、卡那霉素(kanamycin，Km)、氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)6种抗结核药品进行敏感性测定。结果判断标准：含药培养基与对照培养基表面菌落数之比≥0.01判断为耐药。

三、质量控制

每批试验均以MTB标准株H37Rv作为对照。省级结核病参比实验室人员和市/州级结核病实验室人员每年均参加国家结核病参比实验室组织的全国抗结核药物敏感性试验熟练度测试并获得优秀和合格证书，保证实验室检测的标准性和质量。

四、耐药结核病评判标准

单耐药结核病(mono-resistant tuberculosis, MR-TB)、多耐药结核病(poly-resistant tuberculosis, PR-TB)、MDR-TB、准广泛耐药结核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis, Pre-XDR-TB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)、利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB)6种耐药类型,参考中国防痨协会《耐药结核病化学治疗指南(2019年简版)》[1]的概念。

五、统计学处理

应用Excel 2010软件建立数据库，采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析，计数资料采用“率 (%)”表示,以χ2检验对组间差异进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 不同地区耐药类型与耐药率

154株MTB菌株中全敏感菌株97株，耐药菌株57株，总耐药率为37.01%(57/154)，单耐药率为23.38%(36/154),多耐药率为3.25%(5/154), 耐多药率为10.39%(16/154)，利福平耐药率为18.18%(28/154)，广泛耐药率为0.00%。不同地区总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率、利福平耐药率的比较，差异均有统计学意义(χ2=7.21、72.00、5.00、22.49、27.15，P值均<0.05)，3个地区均为黄南州的耐药率高于玉树州和果洛州。见表1。

二、 初、复治耐药类型与耐药率

初、复治患者总耐药率相比，复治患者明显高于初治患者。复治患者的总耐药率、单耐药率、耐多药率、利福平耐药率明显高于初治患者，差异均有统计学意义(χ2=123.00、28.12、11.68、24.07，P值均<0.05)，复治患者的多耐药率与初治患者多耐药率差异无统计学意义(χ2=5.00，P>0.05)。见表2。

三、 任何耐药率情况

6种抗结核药品的任何耐药率为69.48%(107/154)，由高到低依次为：异烟肼(24.68%,38/154)>利福平(18.18%,28/154)>链霉素(11.04%,17/154)>氧氟沙星(8.44%,13/154)>乙胺丁醇(5.84%,9/154)>卡那霉素(1.30%,2/154)。

四、 不同社会学特征患者耐药情况分析

154例患者的性别(χ2=57.00，P<0.01)、年龄(χ2=118.51，P<0.01)、民族(χ2=288.37，P<0.01)和职业(χ2=371.17，P<0.01)的总耐药率差异均有统计学意义。见表3。

讨 论

在全球30个结核病高负担国家中,中国的结核病死亡率为2.6/10万，结核病死亡率排在30个高负担国家中的第29位，仅高于巴西[6]。耐药结核病，尤其MDR-TB是全世界面临的巨大挑战，MDR-TB治愈率低，约为50%[7-8]，病死率却高达52%[9]。据2010年全国结核病流行病学抽样调查显示，西部地区结核病疫情严重，患病率高达695/10万，高于全国平均水平[2]。2009—2012年青海省在农、牧民中发现活动性肺结核患者10 393例，占全部活动性肺结核患者总数的73.62%，提示农牧区的活动性、涂阳和菌阳肺结核患病率高于城镇[10]。

表1 青南地区MTB临床分离菌株的耐药类型分布[耐药株数(耐药率，%)]

表2 初、复治患者MTB临床分离株的耐药类型分布[耐药株数(耐药率，%)]

表3 不同社会人口学特征患者耐药情况分布[耐药株数(耐药率，%)]

本研究结果显示，青南地区结核病患者总耐药率为37.01%，耐多药率为10.39%；复治患者总耐药率为64.52%，复治患者耐多药率为35.48%，分别高于全国第五次结核病流行病学抽样调查结果(36.8%、6.8%；35.9%、15.4%)[2]。总耐多药率为10.39%，复治患者耐多药率为35.48%，初治患者耐多药率为4.07%；复治患者耐多药率远高于全国第五次结核病流行病学抽样调查结果，初治患者耐多药率略低于全国第五次结核病流行病学抽样调查结果(分别为15.4%、5.4%)[2]。复治患者耐多药率远高于初治患者，原因可能一方面与长期服用以异烟肼和利福平为主要方案的抗结核药品有关，增加了MTB耐药性的产生。另一方面可能因为处于偏远地区，经济条件相对比较落后，很多农牧民族在发现得了结核病后在药店自行购买药品，症状有所缓解后便停药，服药很不规范; 当知道结核病的免费政策后到疾病预防控制中心(或定点医院)就诊，也不能按时服药，造成大量耐药患者的发生[11]。因此，笔者认为对青南地区应该进一步加强耐药结核病患者的归口管理，规范合理临床用药，控制耐药性的关键环节。

利福平耐药涵盖所有对利福平耐药的情况，包括单耐药、耐多药、多耐药和广泛耐药[12]。2007—2018年的研究结果显示，初治患者利福平耐药率为6.6%，复治患者利福平耐药率为30.0%；2013年初治患者利福平耐药率为7.1%，复治患者利福平耐药率为24.0%；高于全球初治和复治患者利福平耐药率(3.6%、17.0%)[13]。本次研究结果显示利福平耐药率为18.18%，其中初治患者为13.01%，复治患者为38.71%，高于2007—2018年和2013年两次全国耐药基线调查结果，提示该地区利福平耐药结核病疫情非常严重。杨仪等[14]认为，利福平耐药会明显降低一线抗结核药品的疗效，同时MTB也会很快发展为对异烟肼耐药，成为MDR-TB。据WHO 2019年全球结核病报告，2018年全球估计约有48.4万例新发利福平耐药结核病患者，而这些患者中有78%为MDR-TB。在MDR-TB患者中，有6.2%估计为XDR-TB。有3个国家占了全球50%的MDR/RR-TB患者，分别为印度(27%)、中国(14%)和俄罗斯(9%)[6]。所以在今后的工作中更应该重视利福平耐药结核病的实验室诊断，加大政府投入，规范、合理临床用药，早发现、早诊疗，有效阻止MDR/RR-TB的传播。

本研究结果显示，异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星的任何耐药率分别为24.68%、18.18%、5.84%、8.44%，均高于2013年全国耐药监测结核病患者单耐药谱构成比(14.69%、9.55%、3.5%、6.2%)[13]。提示青南地区MDR/RR-TB疫情较为严重。

本次研究结果显示，性别、年龄、民族、职业等人群特征总耐药率差异均有统计学意义。耐药MTB流行因素多而复杂，居住地为农村、文化程度为初中及以下、当地医疗水平、患者家庭收入、治疗不规范、年龄、性别等均是MTB产生耐药性的危险因素[15-17]；男性总耐药率高可能与抽烟、不良生活习惯等有关；本次研究显示中青年组(<45及45～60岁)总耐药率高，与陈燕梅等[18]的研究结果相近。原因可能与中青年为家庭中的主要经济来源，生活、工作压力大，出入环境复杂，生活不规律造成免疫力下降而成为高危人群。藏族、蒙古族总耐药率高，一方面是本次样本收集人群主要以藏族为主，另一方面与该民族长期居住在帐房的生活习惯相关，为便于保暖，帐房通风较差，造成空气不能流通，易造成呼吸道疾病的传播。学生总耐药率高，可能与生活环境及饮食有关。学生发病主要在牧区，学校以寄宿制为主，群体较为聚集。另外，青少年处于生长阶段，而寄宿制学校的食堂能否满足学生生长所需的营养需进一步了解，如此环境易患结核病[19]。另外，可能与学校结核病防控工作不完善有关。梁军和文国颖[20]对青海农牧区居民的结核病防治行为倾向调查显示: 如果有类似肺结核的症状，约40.00%的人选择不就医，高达10.00%的人表示不知道如何处理。农牧民对结核病防治知识认识不足、就医不及时、患者自行买药或不按照抗结核治疗规则服药，这些因素都极易导致抗结核治疗失败，并有可能产生耐药性。由于本次样本量较小，对人群特征耐药类型未作进一步统计学分析。

本研究广泛耐药率可能比实际情况略低，因为二线抗结核药品在本次试验中只选择Ofx和Km两种，MDR-TB还可能对其他未测二线抗结核药品耐药，而使XDR-TB未检测出,造成其比率可能比实际低。

综上所述，青海南部地区MTB对6种常用抗结核药品的耐药率较高，应加强对中青年、学校、农牧民等重点人群耐药性监测与治疗，强化农牧区工作，进一步落实农牧民等重点人群薄弱环节的结核病防治措施[21]，早发现、早诊断、早治疗，减少耐药的产生。