浅析猪流行性腹泻病毒的蛋白结构和诊断方法

赵洪君 王宝东 周洪伟

文献综述

浅析猪流行性腹泻病毒的蛋白结构和诊断方法

赵洪君①王宝东②周洪伟①

（①辽宁省桓仁县农业发展服务中心 117200 ②辽宁省畜牧业经济管理站 辽宁 沈阳）

猪流行性腹泻是由冠状病毒引起的猪的肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻和脱水，严重的引起猪的死亡，各个年龄段的猪都具有易感性，其中对仔猪的危害最为严重，常常导致仔猪死亡。该病目前在世界范围内流行范围比较广泛，对我国的养猪业造成的损失比较严重。本文重点论述猪流行性腹泻病毒(PDEV)的蛋白结构和诊断。

1 PDEV蛋白结构与功能

1.1 S蛋白 S蛋白是由1383个氨基酸组成的位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合中发挥重要的生物学作用[1]。由于其含有PEDV的主要抗原决定簇，有很好的免疫原性，所以在机体的抗病毒免疫中起到很重要的作用，而且他在结构蛋白中的含量是最高的[2]。用制备的免疫血清作为PEDV抗原检测的试剂是最好的选择。从N端到C端有三个组成部分，分别是受体结合域、抗原区和膜融合区[1]。

1.2 M蛋白 M蛋白是一种穿膜蛋白，由226个氛基酸构成。M蛋白在感染细胞内位于高尔基体内，由糖基化N末端区、中间短的α螺旋区和病毒囊膜中大的C末端区三个结构构成的，不可以转运到被感染细胞的细胞膜[1]。M蛋白不仅在病毒粒子的组装和出芽过程中起到重要的作用，还是刺激机体可以产生免疫保护的结构蛋白[1]。除此以外还可以介导机体干扰素的合成，所以M蛋白在对PEDV的研究和疫苗的研制有重要意义。

1.3 ORF3 ORF3是非结构蛋白，由223个氨基酸构成，是PEDV中唯一的辅助蛋白，该蛋白的具体功能目前还不能确定[2]。通过一些学者的研究，可以发现通过改变ORF3基因，然后检测PEDV的毒力，发现PEDV的毒力下降了，所以推测PEDV的毒性强弱和PEDV的细胞适应性是由ORF3基因所决定的。在PEDV的连续传代培养过程中很轻松筛选到变异的ORF3，可以说明ORF3并不稳定[2]。由于ORF3目前研究的并不多，因此ORF3是研究PEDV的重要方向。

1.4 N蛋白 441个氨基酸组成了N蛋白，是结构蛋白中所占比例最大的磷酸化的核衣壳蛋白，PEDV感染细胞后，细胞中产生最多的病毒蛋白。N蛋白有6到7个潜在的磷酸化位点，在pH9.0低渗非离子溶剂中溶解度最大，而且可以和病毒多聚酶反应[2]；还有可能同细胞因子反应，对宿主细胞的转录产生影响，所以在病毒RNA的合成中起到重要的作用；还可以与磷脂和细胞膜想结合，促进病毒的合成和形成RNA的复制体。N蛋白是一种多功能的磷酸化蛋白，是冠状病毒对宿主感染后，细胞中合成最多的病毒蛋白的一种，而且其结构的稳定性，N蛋白在PEDV分子生物学诊断上有很好的应用前景[5]。N蛋白还可以像调节蛋白那样，干扰宿主的细胞周期，抑制干扰素的合成，诱导细胞凋亡等。

1.5 E蛋白 E蛋白是PEDV中最小的结构蛋白，由76个氨基酸组成，分布在病毒的囊膜上，对病毒的自我组装和出芽过程中起重要作用[10]。2009年以来，国内为了提高繁殖率增加经济效益，许多大型的规模化养猪场的母猪数开始增加。从现有的案例看，猪场的增加母猪的数量对PED的流行情况有很大的影响[11]。在局部地区PED暴发后，如果不及时釆取相应的防控措施，会加速PED的蔓延，进而造成严重的损失[12]。

2 PED的诊断

（1）临床和实验室对猪流行性腹泻的诊断需要评估大肠杆菌，猪传染性胃肠炎等可能引起相似症状的情况。大肠杆菌性腹泻一般感染1周龄以下或者断奶4~10d的猪，而地方性猪传染性胃肠炎，球虫病和猪流行性病毒腹泻感染1周龄以上的猪[13]。然而，因为猪流行性腹泻病毒感染幼年猪的情况越来越频繁，生产者可能会认为猪都有大肠杆菌病，除非他们提供一头猪进行全面的诊断。实验室诊断腹泻病需要发病24h以内的粪便或肠内容物样本。一些对诊断有帮助的实验方法包括：组织病理学法，电子显微镜，荧光抗体，反转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附测定。电子显微镜可用于检查粪便或肠道内容物中的病毒颗粒[14]。但是，电子显微镜并不是在所有的实验室诊断中都能派上用场的，而且电子显微镜也不能区分猪流行性腹泻病毒和非猪流行性腹泻病毒在形态学上的区别。（2）猪流行性病毒和非猪流行性腹泻病毒可以用血清学实验比如EM，FA和ELISA等加以区别，所有这些实验都需要高特异性抗血清。目前，商用FA和ELISA试剂只能用于侦测猪流行性腹泻病毒。FA是猪腹泻早期阶段最广泛使用的实验法之一。从小肠内壁挂出组织并用猪流行性病毒抗体偶联至荧光染料。猪流行性病毒感染的细胞会与FITC抗体反应，当被一定波长的光激发时会散发出明亮的苹果绿荧光。在ELISA实验中，抗体与病毒被涂到一个小的塑料管底部，将粪便样品加入到塑料管中，如果样品中有猪流行性腹泻病毒，将会被塑料管中的抗体捕获。然后加入另一种猪流行性腹泻病毒的抗体，这种抗体具有可以偶联猪流行性腹泻病毒的酶，如果病毒被捕获，那么含有偶联酶的抗体就可以附着在病毒上。最后，加入可以产生肉眼可见颜色变化的共轭酶到底物中。如果产生颜色变化，说明酶附着在了被捕获的猪流行性腹泻病毒上，由此可得出猪流行腹泻病毒呈阳性的结论。ELISA可以用粪便或肠道内容物来作为样品，并具有高灵敏度，对样品量要求少，出结果快的优点。RT-PCR实验也可以从粪便样品中提取猪流行性腹泻病毒核酸，如果样品中有猪流行性腹泻病毒核酸，将认为在样品中含有足够量的猪流行性腹泻病毒核酸阳性反应。扩增后的猪流行性腹泻病毒核酸可在UV光下用特俗的荧光染料使它可视化。血清学诊断也有一定帮助，因为大多数猪都含有阳性猪流行性腹泻病毒抗体。

2.1 原位杂交技术 原位杂交技术是利用核酸分子单链之间的互补的碱基序列与已经标记的待测的DNA或RNA配对形成核酸杂交分子[15]。经过一定的检测手段将待测的核酸的位置显示出来。

2.2 免疫荧光法(IF) 免疫荧光技术是在免疫学和生物化学相结合在显微镜下观察的一项技术，主要是根据抗原抗体进行反应的原理来用荧光标记的方式进行检测[16]。目前，直接免疫荧光法检测PEDV是可靠的特异性诊断方法，应用的范围广。

2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是指将可溶性的抗原或抗体结合到载体上，利用抗原抗体的特异性结合，既可以定性还可以定量的检测方法，也是国际贸易规定的标准诊断方法之一。现在很多养猪场都采用ELISA方法进行诊断。对仔猪的粪便进行检测，直接可以检测到PEDV。

3 预防猪流行性腹泻的措施

3.1 做好保温 对于保育舍的保温可以采用封闭保育舍的窗户的方法，能够形成一个相对封闭的环境，使舍内的温度升高。还可以通过煤炭等能源的燃烧给猪舍供暖以达到适宜的温度。采取这种方法供暖时，应该注意通风换气使舍内的空气良好，因为如果燃烧的不充分。会在这个过程中产生有毒气体主要是一氧化碳，会使猪舍内的猪中毒严重的会出现死亡，造成不必要的损失。有条件的规模化猪场可以建设猪粪发酵池，通过发酵产生清洁安全的沼气，可以用于猪舍的保温，提高猪场的循环利用率。

3.2 加强保健 通过注射疫苗增强出生仔猪抵抗病毒感染的免疫力。通过诱导仔猪自身产生足够的干扰素，来激活机体免疫系统的免疫功能。而且对于混合或继发感染大肠杆菌的PED育肥猪和保育猪，则很难治疗，造成的后果也是十分严重的，只能通过把适量添加抗生素放在饲料中来防止细菌的感染。

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（2020–05–14）

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