酶法辅助共发酵奶啤的工艺优化

郭水连，赵晓晴，庄钰蓉，黄燕燕，余佳佳，赵珊，刘冬梅

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州，510641)

奶啤是一种以全脂或脱脂乳为原料，经乳酸菌、酵母发酵而成的具有酸奶与啤酒糅合后的独特香气的低酒精乳饮料[1-2]，其风味主要由微生物酶分解乳制品中蛋白质、脂肪和碳水化合物而产生的醇类、酯类、醛类、酸类、酮类组成[3]。

酶法辅助生产在制取功能性多肽、提高澄清度等[4-5]方面应用广泛。蛋白水解产物对德氏乳杆菌及嗜热链球菌有增殖作用，隋欣等[6]表明蛋白水解酶处理后的脱脂奶培养基适宜乳酸菌混合菌株的生长。由于酶水解液含有大量苦肽，奶酪中常添加外肽酶来消除苦味，如氨肽酶等[7]。

奶啤通常由乳酸发酵及酒精发酵两步制成，而本试验让两者同时发酵。发酵过程中菌株的含量、种类及比例关系对奶啤风味有一定程度的影响。付鸿等[8]表明乳酸单菌发酵没有混合菌效果好,以杆菌和球菌按(1～2)∶1混合制得酸奶口感最佳。洪家丽等[9]表明乳酸菌因能显著提高酵母菌有机酸含量而促进其生长。顾悦等[10]表明酿酒酵母因提高发酵乳中游离氨基氮、苹果酸等含量和酒石酸等生成速率而促进屎肠球菌的生长。

本文采用共发酵酶解乳液制备新型奶啤，考察不同酶种类、酶活、杆菌和球菌比例、酵母含量等因素对奶啤发酵的影响，并通过Box-Behnken试验确定奶啤的最佳工艺，为新型奶啤的商业化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂乳粉，雀巢(中国)有限公司；嗜热链球菌(DMST-H2，保藏编号GDMCC NO.60642)、德氏乳杆菌(DMLD-H1，保藏编号GDMCC NO.6045)，实验室保藏；安琪牌酵母，市售菌株；低聚果糖(95%)，江门量子高科生物股份有限公司公司；菠萝蛋白酶(CAS：9001-00-7)、木瓜蛋白酶(CAS：9001-73-4)、中性蛋白酶(Neutrase 0.8 L)，诺维信(中国)生物技术有限公司；白砂糖，市售食品级；MRS培养基、生理盐水、孟加拉培养基，按标准方法配制。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；MK3超净工作台，上海日岛科学仪器有限公司；FA2004B分析天平，上海精科科学仪器有限公司；KDC-40恒温培养箱，科大创新股份有限公司中佳分公司；SHZ-88A立式高压灭菌锅，江苏太仓市实验设备厂；pHS-3C精密pH计，上海日岛科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 奶啤制作工艺流程

奶啤制作工艺流程如下：

配制原乳液→分装→酶水解→灭菌灭酶→冷却→酶解液发酵→奶啤

配制原乳液：将脱脂奶粉、白砂糖、益生元、水以质量比10∶10∶1∶79溶解；酶水解：常温下水解4 h；灭菌灭酶：85 ℃，20 min；共发酵：酶水解液接种德氏乳杆菌、嗜热链球菌及安琪酵母，于30 ℃发酵15 h。

1.3.2 奶啤发酵工艺的确定

1.3.2.1 单因素试验

按照1.3.1配制的原乳液，分别选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解，酶活分别为200、400、600、800、1 000 U/mL，常温下水解4 h，于85 ℃灭菌灭酶20 min。向酶水解液中添加杆菌和球菌比例分别为10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10，添加酵母数量为105、106、107、108CFU/mL，30 ℃共发酵15 h，考察奶啤的感官评分及pH值、活菌数(酵母和乳酸菌数)[11-12]。

1.3.2.2 Box-Behnken试验设计方案

参照段琳琳等[13]研究进行改进，筛选3个因子进行优化处理，在单因素实验的基础上设计响应面中心点，用Design Expert 8.0.6 Trial进行试验设计和分析，具体如表1所示。

表1 采用 Box-Behnken 试验设计因素水平及编码Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3.3 感官评定

采用感官鉴定评分法，由10位感官评价员分别对奶啤颜色、口感、组织形态、气泡、气味进行评价。评价标准及评分改进参照胡曼等[14]的研究。评分细则如表2所示。

1.3.4 数据处理

所有试验均重复3次；采用系统软件Design-Expert 8.0.6 Trial进行响应面分析；采用系统软件SPSS进行显著性分析，P<0.05认为差异显著。

表2 奶啤感官评分标准Table 2 Sensory rating criteria of milk beer

2 结果与分析

2.1 不同酶种类对奶啤感官评分和发酵参数的影响

木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及中性蛋白酶对奶啤感官评分和发酵参数影响如图1所示。由图1-A可知，3种蛋白酶的感官评分存在显著性差异(P<0.05)。唐霄等[15]表明中性蛋白酶酶水解鹅肉蛋白产生的游离氨基酸类型丰富，酶解液风味好且鲜味浓郁。不同蛋白酶协同菌株发酵所得pH显著不同(P<0.05)，其中菠萝蛋白酶对应pH最低,木瓜蛋白酶对应pH最高。从图1-B可以看出，中性蛋白酶酶解液对酵母和乳酸菌的生长均起到较好的促进作用；木瓜蛋白酶对乳酸菌生长效果最好，对酵母效果最差，但菠萝蛋白酶作用效果与其相反。酶解所得的多肽和氨基酸可作为菌株的增殖因子，促进乳酸菌和酵母的增殖。李雪霞等[16]表明酪蛋白酶解产物可有效促进益生菌的生长。马宇骥等[17]和邵志芳等[18]表明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶对乳酪蛋白的水解度分别为(25.25±0.35)%、(6.83±0.05)%、(9.56±0.2)%。综合考量感官评分和发酵参数指标，中性蛋白酶酶解液的发酵效果最好。

A-对pH值及感官评分的影响；B-对酵母菌数和球菌 与杆菌比例的影响图1 不同酶种类对奶啤的影响Fig.1 The effects of different enzymes on milk beer

2.2 不同酶活对奶啤感官评分和发酵参数的影响

不同酶活性对奶啤感官评分和发酵参数影响如图2所示。由图2-A可知，随着中性蛋白酶酶活性增强，感官评分升高，但当酶活>800 U/mL时，感官风味下降。CINDY等[19]表明蛋白质水解液中存在含脯氨酸等疏水性氨基酸残基,而此类残基刺激味蕾产生苦味，故过高酶活会影响奶啤风味。通过感官品尝得知，向酶水解液中接入乳酸菌和酵母共发酵可降低苦味。刘萌等[20]表明酵母的脱苦效果优于乳酸菌,因为乳酸菌代谢肽酶属于胞内酶,而酿酒酵母在细胞壁存在端肽酶，脱苦机理是乳酸菌先产生内切酶将完整蛋白分子水解成肽链, 酵母菌再产生端肽酶将疏水性氨基酸残基切除。随着酶活性增强，pH值呈先降低后上升的趋势(图2-A)。从图2-B可知，随着酶活性增强，酵母数量显著增多(P<0.05)。杨泓喆[21]表明中性蛋白酶水解产生的肽和氨基酸，为酵母发酵提供足够氮源。随着酶活性增强，乳酸菌数增加，但酶活性为400、600、800 U/mL协同混合菌共发酵之间无显著性差异(P>0.05)。综合考量感官评分和发酵参数指标，最优酶活性为800 U/mL。

2.3 杆菌和球菌比例关系对奶啤感官评分和发酵参数的影响

接种德氏乳杆菌和嗜热链球菌107CFU/mL，不同杆菌和球菌比例对感官评分和发酵参数影响如图3所示。由图3-A可知，杆菌和球菌比例为1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1时，各组感官评分无显著性差异(P>0.05)。随着球菌接种量提高，比例为2∶1和1∶5的两组pH值较低。除2∶1和1∶10外的各组别，随着比例降低，菌落数逐渐增多(图3-B)。杆菌和球菌比例趋近于1∶1时，酵母菌落数增多，在比例为2∶1时达到最高。李变变[22]表明杆菌∶球菌为1∶1时, 两菌共生效果较佳。综合考量感官评分和发酵参数指标，杆菌∶球菌最优比例为2∶1。

A-对pH值及感官评分的影响；B-对酵母菌数和球菌 与杆菌比例的影响图2 不同酶活性对奶啤的影响Fig.2 The effects of different enzyme activities on milk beer

A-对pH值及感官评分的影响；B-对酵母菌数和球菌 与杆菌比例的影响图3 不同杆菌、球菌比例对奶啤的影响Fig.3 Influence of ratio of different Bacilli to Cocci on milk beer

2.4 不同酵母数量对奶啤感官评分和发酵参数的影响

不同酵母量对感官评分和发酵参数影响如图4所示。由图4-A可知，比较酵母数量为105、106、107CFU/mL组别，随着酵母数量增加，感官评分增加，但组别之间差异不显著(P>0.05)。当酵母数量为108CFU/mL，奶啤对应pH最高，而酵母数量为105、107CFU/mL 时pH较低。由图4-B可知，随着酵母数量增多，乳酸菌数显著增多(P<0.05)，说明酵母菌与乳酸菌协同生长。VILJOEN[23]表明酵母菌为乳酸菌提供丙酮酸盐、氨基酸和维生素等必需营养因子而促进乳酸菌生长。这与ROOSTITA等[24]和REYES-SNCHEZ等[25]结果不同，他们认为马克斯克鲁维酵母菌因分泌脂肪酶分解乳脂肪为游离脂肪酸而抑制乳酸乳球菌生长。当酵母数量达到108CFU/mL时，酵母死亡率大于出生率，原因可能是酵母数量过多，而糖含量有限，无法提供充足的营养物质，其次乙醇含量增多也会导致酵母生长率降低。NISARUT等[26]表明高浓度乙醇会抑制葡萄糖和氨基酸转运，导致丙酮酸激酶和己糖激酶等关键糖酵解酶变性，并增加膜的通透性，使酵母丧失正常生理功能，但具体原因还有待研究。综合考量感官评分和发酵参数指标，并考虑生产成本，最优酵母数量为107CFU/mL。

A-对pH值及感官评分的影响；B-对酵母菌数和球菌 与杆菌比例的影响图4 不同酵母量对奶啤的影响Fig.4 Effects of different yeast contents on milk beer

2.5 响应面试验

2.5.1 Box-Behnken 试验结果

Box-Behnken设计与结果如表3所示，利用Design Expert 8.0 进行分析和多元回归拟合，建立以感官评分为目标函数的二次回归方程，并对回归方程进行方差分析和显著性检验。

2.5.2 方差分析

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface experimental design and results

表4方差分析显示，该回归模型显著(P<0.05)，说明感官评分与各个变量之间存在显著的线性相关，失拟性在置信区间95%水平上不显著，即方程失拟度较小，可利用该模型预测响应值感官评分与变量之间的关系。

表4 回归方程方差分析及显著性检验Table 4 Test of significance for regression equation coefficients of sensory evaluation

回归方程绘制等高线和响应面图如图5所示，酵母数量与杆菌和球菌比例交互作用显著，与表4中交互相P值的分析结果一致。响应面的坡度较陡峭，表明感官品评的响应值对酵母数量与杆球之比的变化较为敏感。在酵母数量不变的条件下，随着杆球菌比值的提高，响应值先逐渐升高再逐渐降低；在杆球菌比值不变的条件下，随着酵母数量升高，响应值先逐渐升高再逐渐降低。

a-杆球菌比例与酶活性的交互；b-杆球菌与酵母数量的交互；c-酵母数量与酵母活性的交互图5 任意两变量对感官评分影响的响应曲面图Fig.5 Response surface plots for the effects of any two variables on sensory evaluation

经过响应面分析,并根据拟合二阶模型公式得到理论上感官评分最大值为84.3，此时奶啤发酵工艺的最优理论条件为杆菌∶球菌值为1.7，酵母数量为5.3×107CFU/mL，酶活性为788 U/mL。考虑到实际操作的可行性，将上述最优条件修正为杆菌∶球菌为1.5，酵母数量为5.0×107CFU/mL，酶活力为800 U/mL，此时理论的感官评分为84.2。

2.5.3 最佳条件的验证试验

为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化奶啤生产工艺，进行3次平行试验，结果测得感官评分为84.0，与预测值基本一致，说明通过上述实验方法得到的最优发酵条件可靠，具有参考价值。同时测定最优生产工艺时其他理化指标，酵母数量为6.5×107CFU/mL，细菌数量为4.0×1011CFU/mL，pH值为4.74。

3 结论

实验结果表明，以感官评分为响应值，经响应面优化奶啤的最佳发酵条件为杆菌与球菌比例为1.5∶1，酵母数量为1.0×107CFU/mL，酶活力为800 U/mL。在该发酵条件下，奶啤中酵母数量为6.5×107CFU/mL，细菌数量为4.0×1011CFU/mL，pH值为4.74。本试验运用响应面优化方法可为工业发酵优化提供参考。