补阳还五汤防治脑缺血再灌注损伤的研究进展

单玉栋，高维娟

(河北中医学院 河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑卒中是临床常见病，具有致死率高、致残率高和易复发的特点，其中缺血性脑卒中的发病率约占全部脑卒中的70%[1]。随着社会不断发展，人们日常生活饮食习惯的改变，脑卒中的发病率不断提高，缺血性脑卒中的预防和治疗是临床亟须解决的重要问题[2]。梗死组织周边缺血半暗带的恢复再通是缺血性卒中的首选治疗方法[3]。然而，脑血流再灌注会引起一系列的病理过程，导致进一步的损伤，这被称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。研究发现，补阳还五汤对CIRI有较好的疗效，现就补阳还五汤复方及单药组分在CIRI中的作用机制进行如下综述。

补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》，其方根据气虚血瘀理论而立，全方共7味药，由黄芪、桃仁、红花、当归尾、地龙、川芎、赤芍组成。方中重用黄芪为君药旨在补气行血，又配伍当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙等药物以补气通络、活血化瘀，广泛应用于缺血性脑卒中的临床防治。

1 补阳还五汤复方在防治CIRI中的作用

1.1 抑制兴奋性氨基酸毒性

兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)毒性是指各种因素过度激活EAA转运体受体，使其功能亢进导致神经元异常兴奋，最终导致细胞死亡的过程[4]。EAA主要包括谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等，存在于神经元胞体内和神经元突触末梢，是神经系统的重要兴奋性神经递质，缺血时中枢神经系统(CNS)释放大量的Glu在CIRI发病机制中起到重要的作用[5]。EAA对神经系统的损伤机制主要可以概括为：①兴奋性氨基酸转运体(EAATs)受到抑制，CNS对谷氨酸清除能力减弱，从而使谷氨酸大量积累对神经元造成损伤[6];②激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA)受体，使Ca2+内流导致细胞内钙超载进一步造成迟发性神经元损伤[7];③激活代谢性谷氨酸(metabotropic Glutamate，mGlu)受体，使细胞通透性发生改变，大量离子进入细胞，进而导致水肿对细胞造成损伤[8]。YU等[9]通过研究补阳还五汤血清(BYHWD-CS)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)后星形胶质细胞(astrocyte，AC)谷氨酸转运体蛋白(GLT-1)和谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白水平的影响，发现BYHWD-CS能提高AC中GLT-1和GS的表达水平，降低培养液中Glu的浓度，提示补阳还五汤可以降低CIRI后Glu水平。亦有研究[10]发现补阳还五汤能够降低脑缺血/再灌注后Glu水平、上调AC中GLT-1和GS的表达，并且垂体腺苷酸环化酶激活肽-38(PACAP-38)参与了此调节过程。

1.2 抑制钙超载

缺血/再灌注会导致细胞内Ca2+分布紊乱，细胞内Ca2+浓度异常升高，这就被称为钙超载。缺血/再灌注会使细胞内L-型钙通道、Na+/Ca2+交换蛋白、Na+/H+交换蛋白、溶酶体等功能异常，进一步导致细胞蛋白水解、细胞过度收缩和线粒体衰竭，最终导致细胞损伤。钙超载既是各种因素造成的综合结果，也是造成CIRI过程中各种因素作用的共同通路。细胞内Ca2+超载对脑缺血/再灌注后神经元细胞的损伤机制[11]：①Ca2+大量流入细胞内，一方面造成线粒体膜损伤，另一方面抑制ATP生成造成能量供给不足，进而导致线粒体功能障碍引起神经元损伤;②导致脂质代谢紊乱，激活脂蛋白相关磷脂酶A2 (LP-PLA2)和C反应蛋白(CRP)，使细胞膜通透性和流动性增大;③导致5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)及弹性蛋白酶释放，造成局部血管痉挛加重脑缺血。有研究表明[12]补阳还五汤能显著增加海马CA1区细胞外信号调节激酶2(ERK2)和钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的表达，保护海马神经元免受缺血再灌注损伤。研究人员[13]在补阳还五汤对红核神经元L-型钙通道(ICa-L)电流活动影响的实验中发现，补阳还五汤中、高剂量组的开放时间、开放概率均低于模型组，提示补阳还五汤能够抑制神经细胞ICa-L的开放防止钙超载。

1.3 抑制自由基损伤

人体正常情况下细胞内的自由基是动态平衡的，细胞在缺血状态下自由基的清除被抑制，而细胞缺血时自由基的产生能力反而增加，细胞缺血/再灌注后会造成自由基急剧增多对神经元造成损伤[14]。活性氧簇 (Reactive oxygen species，ROS)是一组高活性分子，是重要信号通路的调节因子。生理浓度下，ROS 作为信号分子调节细胞的生长、分化、衰老、凋亡和自噬；ROS 的病理水平一般被认为是大分子损伤的主要原因。ROS主要包括超氧阴离子羟基自由基 (HO)、烷氧基自由基 (RO)等在内的多种自由基。ROS对细胞造成损害的作用机制[15]：①损伤内皮细胞，破坏血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，使血管的反应性改变。②发生脂质过氧化反应，造成细胞膜、细胞器膜等膜结构变性。SHEN等[16]通过建立过氧化氢(H2O2)诱导的内皮细胞氧化应激模型，探讨了补阳还五汤对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的保护作用及其机制，发现补阳还五汤能明显抑制细胞内ROS的产生，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低血清丙二醛(MDA)水平，从而抑制H2O2诱导的HUVECs凋亡。YANG等[17]通过新生大鼠坐骨神经Schwann细胞进行实验，发现补阳还五汤能够提高H2O2损伤Schwann细胞的生存率，并且提高了SOD活性，降低了MDA含量。综上，补阳还五汤具有抗氧自由基损伤，防治CIRI的作用。

1.4 减轻炎症反应

脑缺血引起的强烈炎症反应包括炎性细胞的黏附、激活和迁移，以及细胞黏附分子和细胞因子的表达上调。核转录因子kappaB(NF-κB)最早是由David Baltimore发现的[18]，该蛋白家族可以选择性地与B细胞κ-轻链增强子结合，进而调控众多基因的表达。NF-κB是起始于细胞外终止于细胞核的级联反应的一部分。NF-κB是细胞内重要的转录调节因子，当细胞受到如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、淋巴毒素、白细胞介素-1β(IL-1β)等的刺激时，该通路会被激活进而诱导多种因子的表达。NF-κB被激活后会介导促炎细胞因子、趋化因子和诱导性酶如诱导型一氧化氮合酶(INOS)和环氧合酶-2(COX-2)等的产生[19]，进而造成细胞功能和结构的损伤[20]。研究人员[21]通过研究补阳还五汤对脑缺血大鼠海马组织的影响，发现补阳还五汤能明显降低NF-κB、TNF-α、IL-1β、Toll受体4(TLR4)及MyD88蛋白(myeloid differentiation factor 88)的表达水平，提示补阳还五汤通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及炎症因子的表达对脑缺血神经元起到保护作用。LIU等[22]研究发现补阳还五汤可以通过脂肪细胞核因子NF-kBp65通路抑制细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)诱导的血管内皮炎症，提示补阳还五汤可以减轻脑缺血炎症，改善神经功能。

1.5 抑制神经元凋亡

细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预设的死亡程序而导致的细胞死亡过程，是细胞程序性死亡的形式之一。细胞凋亡的主要途径：①线粒体通路，与细胞凋亡有关的线粒体蛋白包括：细胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白等。细胞内外各种死亡信号可诱导线粒体释放细胞色素C、AIF等促凋亡因子使细胞内的氧化磷酸化、电子传递和ATP产生等过程遭到破坏，最终导致细胞凋亡[23]。②死亡受体通路，死亡受体属于肿瘤坏死因子受体 (TNFR)基因家族，它是一类跨膜蛋白，细胞外的死亡信号可由其转入细胞内。刘芳等[24]研究发现补阳还五汤类方可以通过氧化应激模型细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5，Cdk5)信号转导途径有效抑制神经元细胞凋亡，对脑缺血/再灌注后的神经细胞损伤起到保护作用。张颖等[25]通过构建大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，发现补阳还五汤能够加强Bcl-2的表达、降低BCL2-Associated X蛋白(Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶8(caspase-8)的表达，从而显著减少神经细胞的凋亡。综上，补阳还五汤能够调节凋亡因子的表达，抑制脑缺血/再灌注后神经元细胞的凋亡。

2 补阳还五汤单药组分在防治CIRI中的作用

2.1 黄芪

黄芪为补气药的代表，具有补气升阳、利水消肿等作用，补阳还五汤中重用黄芪为君药，补益元气，旨在气旺则血行，瘀去而络通。

2.1.1 黄芪甲苷

现代药理学研究发现，黄芪的有效活性成分之一黄芪甲苷(astragaloside IV，AST-IV)，对脑缺血/再灌注神经元损伤有多种保护作用。研究显示[26]AST-IV可以通过抑制TLR4/MYD88/NF-κB信号通路，减少TNF-α、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶等的表达，同时诱导抗炎分子IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)的表达，减轻MG介导的神经元损伤。ZHANG等[27]发现在脑组织中AST-IV可以降低P62蛋白的表达、增加自噬相关蛋白Beclin1及微管相关蛋白1轻链3融合蛋白Ⅰ/Ⅱ(microtubule associated protein1 light chain 3 fusion protein，LC3I/II)的表达来平衡Bcl-2和Bax的表达，从而抑制CIRI细胞凋亡。

2.1.2 毛蕊异黄酮

现代药理学研究证实，黄芪的另一种有效成分毛蕊异黄酮(Calycosin)同样对CIRI有保护作用[28]。HSU等[29]研究发现Calycosin可以增加缺血性脑卒中大鼠大脑中脑源性神经营养因子 (BDNF)及其酪氨酸激酶受体B (TrkB)的表达，使MG从活化的变形状态转变为静息状态，从而减轻神经元损伤。亦有研究[30]发现Calycosin可以减轻OGD/R细胞的凋亡与氧化应激损伤。

2.2 当归

当归具有补血活血的作用，在补阳还五汤中为臣药，旨在通络活血而不伤血。

2.2.1 阿魏酸

当归的有效活性成分之一阿魏酸(ferulic acid，FA)对神经细胞具有保护作用[31]。CHENG等[32]研究发现FA能够上调Akt/mTOR/4E-BP1/Bcl-2抗凋亡信号，进而抑制细胞色素c /caspase-3依赖性凋亡途径，可有效减轻大鼠MCAO模型的脑缺血损伤。CHENG等[33]研究表明FA能够上调热休克蛋白70(heat shock protein,HSP70)/Bcl-2介导的信号转导，抑制Bax和AIF介导的信号通路，保护线粒体外膜完整性，从而保护缺血诱导的细胞凋亡。近期研究[34]证实FA能够抑制Ca2+内流、减少和ROS产生，从而起到抑制神经细胞凋亡的作用。

2.2.2 藁本内酯

亦有研究表明[35]，当归中的有效成分藁本内酯(Ligustilide)能够保存Tight Junction蛋白和抑制HIF-1α/VEGF/Akt通路、肝组织PI3K/Akt/FoxO1通路，对OGD/R诱导的BBB细胞通透性的破坏具有保护作用。

2.3 赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙

方中川芎、赤芍、桃仁、红花协同当归祛瘀活血；地龙通经活络，力专善走，共为佐药。

2.3.1 赤芍

赤芍的有效成分之一芍药苷(paeoniflorin，PF)对脑缺血/再灌注后的神经细胞损伤有保护作用。SHE等[36]研究表明PF能够调控NLRP3介导的经典热休克途径，抑制接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表达，对脑缺血/再灌注后神经细胞损伤起到保护作用。ZHANG等[37]发现PF显著降低了体内神经功能缺损评分和梗死体积，提高神经元的存活率，抑制了体外培养的神经元凋亡和神经元胞内Ca2+浓度，提示PF通过调节Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶II/cAMP反应元件蛋白信号通路对CIRI起到保护作用。

2.3.2 川芎

川芎具有活血行气止痛之功效，其有主要效成分川芎嗪(Ligustrazine)具有抗脑缺血的作用，其机制主要与抑制神经元凋亡、减轻炎症等有关[38]。WANG等[39]研究发现Ligustrazine可改善脑缺血大鼠的神经功能缺损和神经元损伤，促进神经发生，上调轴突生长相关蛋白，减轻炎症应。亦有研究表明[40]Ligustrazine通过激活PI3K/Akt通路在大鼠CIRI中发挥神经保护作用。

2.3.3 桃仁

桃仁为活血化瘀的常用药特效药。动脉粥样硬化是脑血管缺血性疾病的重要病因，研究发现[41]桃仁油可以降低高脂饮食喂养的载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠的总胆固醇并且下调组织因子(TF)的表达，从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。

2.3.4 红花

红花中的主要有效成分为羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)在CIRI中具有保护作用。近期研究[42]发现HSYA具有恢复能量代谢、改善神经功能、减少脑梗死体积、减轻细胞凋亡和自噬、抑制炎症等效应，在CIRI中起到保护作用。YU等[43]通过HSYA对MCAO大鼠JAK2/STAT3与细胞因子信号转导抑制蛋白3 (SOCS3)信号的相互作用的研究，发现HSYA可能通过调节JAK2/STAT3和SOCS3信号通路之间的串扰而对局灶性脑缺血产生神经保护作用。

2.3.5 地龙

地龙为虫药，走窜力强，具有通络的作用。研究显示[44]地龙一方面能够降低活性氧和线粒体超氧化物的产生，抑制炎症性细胞因子的表达；另一方面其能有效抗凝、抑制血小板聚集、改善微循环。能有效防治CIRI，对神经细胞起到保护作用。

3 小结与展望

综上所述，补阳还五汤复方防治CIRI的机理主要通过降低脑缺血/再灌注后Glu、Asp等的水平进而抑制兴奋性氨基酸毒性；通过调节ERK2、CaMKII、ICa-L抑制钙超载；通过抑制细胞内ROS的产生、提高SOD活性、降低MDA水平进而抑制自由基损伤；通过抑制NF-κB 信号通路及炎症因子的表达来减轻炎症反应；通过加强Bcl-2的表达、降低Bax、caspase-3、caspase-8的表达抑制神经元凋亡。另一方面，补阳还五汤单药组分在防治CIRI过程中发挥重要作用，例如：黄芪中的黄芪甲苷能够减轻MG介导的神经元损伤，毛蕊异黄酮能够平衡Bcl-2和Bax的表达进而抑制CIRI细胞凋亡；当归中的阿魏酸能够抑制神经细胞凋亡，藁本内酯能够抑制细胞通透性的改变；赤芍中的芍药苷能够抑制ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表达从而抑制细胞凋亡；川芎中的川芎嗪能够在抑制神经元凋亡同时减轻炎症反应；桃仁能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成；红花中的羟基红花黄色素A能够恢复能量谢同时减轻细胞凋亡和自噬；地龙能够降低活性氧和线粒体超氧化物的产生等。本文就补阳还五汤防治脑缺血再灌注损伤的作用机制进行了详细阐述，补阳还五汤复方及其单药组分在防治CIRI过程中能够多层次、多靶点发挥作用，为进一步防治CIRI提供了参考依据。

但是，补阳还五汤复方内包含的具体单药组分及其作用于体内的具体靶点数量庞大且关系复杂，尚需进一步深入研究。另外，补阳还五汤目前大多数研究限于动物实验，仍需开展大量的临床研究，为缺血性脑病的防治提供更多的应用价值。