中医药干预失眠模型动物的代谢组学研究进展

王亮，李绍旦，王鹏，李晨，侯晓圆，张俊修，张印，杨明会*

(1.解放军总医院中医医学部，北京 100853； 2.解放军医学院，北京 100853；3.解放军总医院研究生院，北京 100853)

睡眠作为大脑中枢神经系统活动的一部分，占人类寿命三分之一。在现代医学中，失眠泛指符合临床指南和诊断标准的失眠障碍(Insomnia disorder)和各类失眠症状(Insomnia symptoms)，中医将失眠统称为“不寐”“不得眠”“不得卧”等，包括睡眠启动困难、难以维持睡眠或清晨醒来无法恢复睡眠等症状，易引发日间功能受损如认知能力下降、疲倦或情绪紊乱等临床上显著痛苦或活动障碍[1-2]。失眠流行病学调查显示全世界约12.1%的人群患有与失眠相关症状[3]，长期睡眠不足不仅会引起高血压、心血管病和糖尿病等慢性疾病[4-7]，还会造成抑郁、焦虑等心理疾病[8]。严重失眠更是影响人类的工作效率、生活质量和记忆力等，也是造成车祸、自杀等事故的高危因素[9-10]。

目前，常见失眠模型动物多采用应激(如心理创伤、强迫游泳)、特殊环境(如噪音、低温)、药物(如对氯苯丙氨酸PCPA、咖啡因)等方法诱导或睡眠剥夺来模拟人类失眠的症状表现[11]。代谢组学(Metabolomics)作为一门新兴学科，通过揭示生物整体、器官或组织内源性代谢物质的生化变化深入了解疾病的生理病理过程[12]。睡眠是必不可少的生物学过程，在机体代谢调节中起关键性作用[13]。睡眠时间缩短与代谢失调的风险有关联，急性睡眠剥夺(Sleep deprivation，SD)可导致血浆代谢谱紊乱[14]。代谢组学的整体性与中医整体观念有异曲同工之妙，建立系统代谢组学分析方法，为中医药提供了可靠的疗效评价机制[15]。随着中医药治疗失眠研究的不断深入[16]，关于失眠的代谢组学分析文献也逐渐增多，但报道比较分散、研究不够深入和代谢产物关联不够密切。本文从中医药干预失眠模型动物的血液、脑组织、脏腑组织、尿代谢物与肠道微生物的代谢组学分析入手，汇总中医药治疗失眠的代谢组学研究进展情况，为深入探索中医药干预失眠的代谢机制提供参考。

1 失眠模型动物之血液代谢组学

1.1 中医之血与失眠

中医认为，“血”源自脾胃运化之水谷精微，化生于脾而受藏于肝，故可濡养周身、平衡阴阳。《灵枢》谓:“肝藏血，血舍魂”“血脉和利，精神乃居。”《景岳全书》不寐篇曰:“血液，灌溉一身，无所不及……以致滋脏腑，安神魂，无非血用也。”因此，血液正常供给才可使人安寐。

1.2 血代谢实验研究

现代血液代谢研究表明内源性昼夜节律钟对机体各种代谢途径有很大影响[17]。在SD后除谷氨酸外，血液中谷胱甘肽成分如甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸及其前体如蛋氨酸、丝氨酸和苏氨酸等显著减少[18]。杨钰涵等[19]研究发现心肾不交失眠模型大鼠中ACTH、CRH增多，并存在磷酸戊糖代谢，谷氨酸、丙氨酸与天冬氨酸代谢，组氨酸代谢，牛磺酸与亚牛磺酸代谢等4条代谢通路。酸枣仁汤干预失眠大鼠的调节代谢作用研究表明，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、酪氨酸代谢和嘌呤代谢是影响其发病的主要代谢途径[20]。研究者应用代谢组学技术检测出失眠后23个显著差异代谢物，发现水芹乙酸乙酯提取物是水芹发挥镇静催眠药效的有效部位，能提升5-HT、TNF-α和IL-1β含量，增加5-HT1a受体mRNA表达，其主要通过影响机体的甘油磷脂代谢、色氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代谢等代谢通路发挥干预失眠的作用。岳贺等[21]研究发现交泰丸干预失眠的作用机制与氨基酸代谢、脂质代谢调节有关，失眠模型大鼠血清低/极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸水平明显升高；经交泰丸干预后，血清低/极低密度脂蛋白回调趋近正常水平，血清中谷氨酸、异亮氨酸显著下调，胆碱、磷酸胆碱显著回调。从中可以看出，血液各代谢成分与中医有关失眠本质阴阳平衡之间密切相关。

2 失眠动物模型之脑代谢组学

2.1 中医之脑与失眠

中医经典《素问·脉要精微论》认为失眠与脑有关，指出:“头者精明之府”“脑主神明”。清·王宏瀚著《医学原始》首次提出睡眠由脑所主的观点。清·郑光祖在《一斑录》载:“人寐则脑与心神相会，梦每因之而成”，强调脑神主调节适应内外环境平衡，维持昼则精明、夜则安眠的生物节律。

2.2 脑代谢实验研究

研究证实睡眠能改善大脑的记忆、情绪和认知功能[22]。研究表明，96 h睡眠异常可引起下丘脑谷胱甘肽水平显著下降，但其他脑区则表现正常。王颖等[23]基于代谢组学平台GC/ MS发现人参糖蛋白(GPr)可能参与嘌呤代谢、烟酸与烟酰胺代谢、甘氨酸、丝氨酸与苏氨酸代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢以及类固醇激素生物合成等脑代谢途径来起到镇静催眠作用。研究表明[24]交泰丸干预失眠的作用机制可能与调节机体氨基酸代谢有关，具体表现在下调失眠大鼠海马组织牛磺酸、甘油磷酸胆碱水平，上调丙氨酸、γ-氨基丁酸水平。慢性SD使大鼠脑脊液中内源性代谢产物发生变化，通过UPLC/Q-TOF-MS检测技术，在正离子模式下大鼠脑脊液中检测到组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸和L-酪氨酸等与睡眠有关因子，其中L-组氨酸和L-丝氨酸随着睡眠剥夺的进行含量升高[25]。这表明在内分泌和神经系统的紧密协调中大脑起到调节昼夜节律的重要作用，特别是大脑与睡眠相关下丘脑、海马区域显著改变和影响代谢物富集分析通路[26]。

3 失眠动物模型之五脏代谢组学

3.1 中医之五脏与失眠

历代医家认为五脏与失眠有着密切的联系，五脏功能失调是导致阴阳气血失和的根本原因，久则引起不寐。人体正常“昼精而夜寐”状态与五脏之神有密切关系，如《素问》曰：“人有卧而有所不安者，脏有所伤。”五脏气化功能正常，气机畅达则机体代谢正常，若五脏气化功能异常，气化无权，气机逆乱，则机体代谢失常[27]。

3.2 五脏代谢实验研究

现代研究证实SD可导致氧化应激升高，增加对谷胱甘肽合成和谷胱甘肽成分耗竭的需求。眼酸被证明是氧化应激反应的新生物标志物，是肝脏谷胱甘肽耗竭的敏感指标[28]。研究表明慢性SD可使胰岛素释放产生障碍，大鼠胰岛β细胞GSIS/KSIS功能明显受损[29]。睡眠限制对昼夜生物学的影响已经确定，发现脂肪酸和脂类时循环代谢物的主要部分之一，受昼夜方式调节的特定脂质如磷酸胆碱是肝脏摄食代谢的特定调节剂[30]。黄晓宇等[31]采用基因芯片测序技术发现SD大鼠模型被天王补心丹干预前后能量代谢差异基因可促进脂代谢、糖代谢与蛋白代谢进程，可能通过下调肝、心的NPY、DUSP1 mRNA表达，参与激活p38 MAPK信号通路。研究人员发现[32]睡眠剥夺SD可引起小鼠肝脏谷胱甘肽代谢、嘧啶代谢、氨基酸代谢及花生四烯酸等多重代谢紊乱。

4 失眠动物模型之尿代谢组学

4.1 中医之尿与失眠

尿液的生成和排泄，与肾气的蒸腾气化直接相关，对维持体内津液代谢平衡至关重要。不寐患者经常出现夜尿频繁(俗称起夜过多)，这与中医“肾主水”的理论息息相关。中医学认为“肾主水，纳气藏精”。清·郑寿全在《医法圆通·不卧》记载：“不卧一证……有因肾阳衰而不能启真水上升以交于心，心气即不得下降，故不卧”，强调为若是肾中真元(精)不足，可导致阳不入阴、神不安守。临床亦发现恐惧、惊吓等不良情绪可使“肾水不固、失济于心”，最终导致失眠。

4.2 尿代谢实验研究

尿液是细胞代谢物的汇集处，其生物基质可用作代谢信息来源，具有易被动、非侵入性和纵向收集，为临床医学诊断的提供了独特和连续的代谢表型。研究发现[33]交泰丸能上调大鼠尿液与失眠相关的二甲基甘氨酸、牛磺酸和苯乙酰甘氨酸水平，下调N-乙酰糖蛋白、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、二甲胺等8种潜在生物标志物，说明交泰丸能对失眠模型大鼠尿液代谢紊乱产生有效的干预作用。沈淑洁等[34]采用代谢组学1H-NMR技术分析发现半夏厚朴汤镇静催眠作用可能与调节失眠大鼠尿液谷氨酰胺、磷酸肌酸、2-酮戊二酸含量来减轻脑内神经兴奋性有关。SD大鼠模型中绿原酸(CGA)可能的抗抑郁机制可能与调节烟酸和烟酰胺代谢的异常途径、乙醛酸和二羧酸酯代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸的代谢等有关[35]。近期报道研究者已使用智能设备应用程序收集了各种生物统计数据，探索尿液代谢物浓度与睡眠、生活方式等其他衡量标准之间的关联性[36]。可见，尿液中的代谢产物对于研究失眠的代谢组学机制具有重要的临床意义。

5 失眠动物模型之肠道菌群代谢组学

5.1 中医之肠道菌群与失眠

《素问·逆调论篇》中述：“阳明逆不得从其道，故不得卧也。”《灵枢·大惑论篇》中载：“其肠胃小……卫气之留于阳也久，故少瞑焉。”说明肠胃功能失常，体积变小，卫气在体表停留时间较长，则不得卧或少眠，可解释为肠胃为促进睡眠提供的能力物质较少或功能弱[37]。肠道菌群失调可导致脾、胃、肠运化功能失常，并通过影响HPA轴的神经递质分泌节律来改变中枢神经系统的认知、思维调节能力。

5.2 肠道菌群代谢实验研究

现代医学肠道微生物-肠-脑轴系列研究提示睡眠与精神、神经、内分泌和免疫多因素的联合作用密切相关，其中肠道微生物-肠-脑轴扮演了重要的角色，是导致失眠的重要环节。睡眠片段和睡眠持续时间短都可能通过激活HPA轴来影响宿主肠道微生物平衡[38]，降低有益细菌属的水平，改变微生物组的代谢功能，同时调节粪便中细菌修饰的代谢产物(如胆汁酸)水平[39]。基于肠道菌群-肠胃-脑轴在失眠中的作用机制，肠道菌群失调可导致胃肠脾运化功能失常，并通过影响HPA轴的神经递质分泌节律，影响中枢神经系统的认知、思维调节能力。酸枣仁总皂苷及转化产物均有镇静催眠作用，总体转化产物较酸枣仁总皂苷药效趋势好，具有维持稳定代谢能力的肠道菌群体外培养体系[40]。李云等[41]研究发现间歇性SD会引起大鼠抑郁样状态和肠道菌群失调，姜黄素能改善SD大鼠的抑郁样状态和肠道菌群失调。研究证实小檗碱对小站台水环境法建立SD模型大鼠肠道菌群结构以及Th17/Treg平衡有调节作用，包括调节其肠道菌群结构， 增加大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量而降低产气荚膜梭菌和肠球菌的数量[42]。研究发现中成药百乐眠胶囊通过脑-肠轴减轻PCPA所致小鼠失眠情况，平衡结肠粪便中神经递质水平，调节肠道微生物群多样性、组成和富集有益菌[43]。研究者发现酸枣仁汤可调整睡眠剥夺应激引起的特定肠道菌紊乱，增加肠道中有益菌数量，减少肠道有害菌数量，改变肠道菌群结构，说明SD过程与肠道菌群的数量及比例结构直接相关[44]。可见，肠道代谢产物作为深入研究中医药干预失眠动物模型的肠道菌群代谢组学的潜在微生物标记物，为“肠-脑轴”理论与中医“胃不和卧不安”经典学说的有机结合提供了研究方向。

6 讨论

随着信息化时代电子产品的不断普及，看电视电影、玩电脑手机、加班熬夜等行为逐渐侵占人类整体睡眠时间，使之呈现明显减少趋势。当前，临床治疗失眠可通过药物疗法、非药物疗法来改善睡眠[45-46]，并减轻由睡眠不足引起的痛苦或功能障碍[47]。失眠的具体机制尚不明确，而代谢物水平可反映人类的营养、生活方式及睡眠质量。研究发现失眠可引起机体代谢功能的紊乱，包括碳水化合物代谢、内分泌以及昼夜代谢过程，代谢基因、时钟振荡和氧化应激也受到急性SD的干扰[48]。在正常昼夜节律下，24 h内新陈代谢控制会跨组织和行为上与时间协调。流行病学证据表明，睡眠周期改变、睡眠时间中断或睡眠质量下降可增加整体代谢综合征的易感性[49-50]。

在医学领域，质谱和核磁共振波谱作为代谢组学的两个主要分析平台，具有潜在的强大应用，如新颖的潜在疾病生物标志物发现[51]、中药方剂疗效评价[52]和中药安全性评价[53]。中医药干预失眠模型的代谢组学应用，通过选择适当的失眠动物如大鼠、小鼠等啮齿类模型为研究基础[54]，分析其代谢组学机制，虽取得了一定的成绩，但仍存在失眠动物模型较为单一、造模成功难以评价、代谢产物之间的关联性不强等难点，均有待进一步深入研究和探索。综上所述，本文将中医药治疗失眠动物模型探究失眠的代谢组学进展情况进行有效整合，分别从其血液、脑组织、五脏组织、尿液和肠道菌群等代谢机理出发，深入分析相关代谢产物对失眠病机、进展和治疗的主要进展，考虑到现有失眠代谢组学国内外文献的局限性，对代谢物库内的动态合成或分解代谢缺乏相应的解释和剖析，而特定代谢物报道分子和单细胞代谢组学的未来工作，为中医药治疗失眠的下一步实验研究和临床路径提供了合适的探索方法。