动物源食品中噻菌灵残留分析的净化方法比较

陈丽霞，许丽建

(琼台师范学院 数理系，海南 海口，571100)

动物源食品是人体补充蛋白质的主要来源，生活中常见的动物源食品包括肉类、蛋类和奶类等[1-2]。近年来动物源食品中各类农药残留引起的质量安全问题被广泛关注[3]，一方面，农药在农作物中使用以后，其残留可能通过食物链进入到动物源食品中[4-5]；另一方面，部分农药可以直接作为动物源食品生产中的杀虫剂、消毒剂等[6]，引发残留风险。因此，为保障动物源食品的质量安全，迫切需要开展动物源食品中农药残留的检测分析方法相关的研究。

液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、分析速度快等优点，可同时测定多种农药残留，近年来被广泛应用于各类植物源和动物源食品的检测分析[7-9]。动物源食品通常包括肉类、内脏、蛋类和奶类等，其脂肪、蛋白质等营养成分含量较高，在农药残留分析时需要净化处理以减少其干扰。我国国家标准《GB/T 20772—2008 动物肌肉中461种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》等报道中使用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)法对样品进行净化处理[10-12]，此外，固相萃取(solid phase extraction,SPE)法[13-15]、QuEChERS法[16-18]在动物源食品检测中也表现出很好的净化效果。

噻菌灵(thiabendazole)属苯咪唑类杀菌剂，是一种内吸性植物杀菌剂[19]，也是动物生长中的广谱性抗寄生虫药[20-21]。本实验选择噻菌灵及其代谢物5-羟基噻菌灵(5-hydroxythiabendazole)，分子结构式见图1。对比研究GPC、SPE和QuEChERS 3种净化方法在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉中的净化效果，为动物源食品的前处理方法提供技术支持。

图1 噻菌灵和5-羟基噻菌灵的分子结构式Fig.1 Molecular of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与样品

实验仪器：超高压液相色谱系统，Waters公司；AB SCIEX API4000+质谱系统，AB公司；ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)Waters公司；GPC VARIO凝胶渗透色谱仪,德国LCTech；高速匀浆机,IKA公司；多管旋涡混合器，北京同德创业科技公司；高速离心机，日本日立公司；旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂。

实验用水均为超纯水，Millipore，USA公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，Fisher Scientific试剂公司；PSA吸附剂(N-丙基乙二胺，分析纯)，Biocomma公司；C18吸附剂(40～63 μm)，上海Anpel公司；NaCl、无水MgSO4(分析纯)，广州化学试剂厂。

噻菌灵和5-羟基噻菌灵农药标准品,购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

猪肉(瘦肉)、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉,均购自海口本地市场，猪肉、猪肝和鸡肉使用绞肉机粉碎，鸡蛋使用匀浆机搅匀，制成待测样。

1.2 分析方法

1.2.1 样品的提取

准确称取猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝或鸡肉样品各5.00 g(精确到0.01 g)放入50 mL离心管中，加入25.0 mL乙腈溶剂进行提取，使用高速匀浆机在15 000 r/min下匀浆1 min。为降低样品中的蛋白质等杂质的影响，在样品中再加入2～3 g NaCl，继续在15 000 r/min下匀浆1 min。将离心管在4 000 r/min下离心5 min，使液体和固体相完全分离，同时使有机相与水相分层，取上层乙腈相溶液待净化。

1.2.2 样品的净化

(1)GPC法

取10 mL乙腈提取液在50 ℃减压蒸干，用乙酸乙酯+环己烷(体积比1∶1)溶液定容至5 mL，使用GPC净化。GPC选择Bio-BeadsS-X3(38～75 μm)作为填料，规格为400 mm×25 mm；使用乙酸乙酯+环己烷(体积比1∶1)作为流动相，流速为5 mL/min；淋洗的预冲时间为15 min，收集时间为10 min。GPC样品在收集后，于50 ℃减压蒸干，用乙腈溶液定容至10.0 mL溶解后，过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。

(2)SPE法

取5 mL乙腈提取液在50 ℃减压蒸干，用固相萃取小柱进行净化。分别用100 mg的C18吸附剂和100 mg的PSA吸附剂装填固相萃取小柱，并在上下方别装入250 mg无水MgSO4吸水。分别用5 mL超纯水和5 mL甲醇活化萃取小柱，用2 mL甲醇溶解样品后上样，用10 mL甲醇溶液分3次进行淋洗。收集淋洗液在50 ℃减压蒸干，用乙腈溶液定容至5.0 mL，过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。

(3)QuEChERS法

取5 mL乙腈提取液于25 mL离心管中，依次加入500 mg的无水MgSO4去除样品中的水分，同时加入100 mg的C18吸附剂和100 mg的PSA吸附剂进行协助净化。剧烈旋涡振荡2 min，将离心管在4 000 r/min转速下离心5 min，取乙腈相溶液过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。

1.2.3 仪器分析条件

色谱条件：超高压液相色谱柱选择ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温设置为25 ℃。流动相分别为乙腈(A)和0.05%甲酸水溶液(B)，流速为0.25 mL/min，以梯度洗脱模式对目标物进行洗脱，确保噻菌灵及5-羟基噻菌灵得到良好分离。洗脱程序：0～1 min，10%A变为60%A；1～3.5 min，60%A变为75%A；3.5～4.0 min，保持75%A；4.0～4.5 min，75%A变为10%A；4.5～5.0 min，保持10%A。

质谱条件：选择电喷雾质谱的正离子扫描和多反应监测模式，仪器的喷雾电压为5 000 V，雾化气压力为379.225 kPa，离子源温度为550 ℃。同时监测噻菌灵和5-羟基噻菌灵，定性、定量离子对及去簇电压、碰撞电压见表1。

表1 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的主要质谱参数Table 1 Working parameter of MS for thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

2 结果与分析

2.1 标准曲线及方法检出限

以质量浓度1 000 μg/mL的噻菌灵与5-羟基噻菌灵标准溶液作为母液，使用甲醇逐级稀释法分别配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL系列标准溶液，以进样标准溶液中目标物的质量浓度(μg/mL)作为横坐标X，以定量离子的峰面积作为纵坐标Y，绘制标准曲线，外标法进行定量。方法的典型色谱图见图2，线性回归方程等相关数据见表2。为保证3种净化方法的可比性，在相同的提取体积和样品稀释倍数下，噻菌灵与5-羟基噻菌灵的定量限[limit of quantitaion(LOQ)，S/N=10]分别为0.002和0.01 mg/kg。我国食品质量安全国家标准GB 2763—2019中规定动物源性食品中噻菌灵的残留定义为噻菌灵与5-羟基噻菌灵之和，其中最大残留限量值的最低值为0.05 mg/kg(禽肉类)，最高值为1 mg/kg(牛肾)，本方法可满足其检测分析的需求。

表2 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的线性回归方程和定量限Table 2 Standard curves and LOQs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

a-1、a-2、a-3、a-4、a-5：噻菌灵在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉样品中的加标 回收色谱图，b-1、b-2、b-3、b-4、b-5：5-羟基噻菌灵在猪肉、鸡蛋、牛奶、 猪肝和鸡肉样品中的加标回收色谱图，加标量均为0.01 mg/kg图2 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的典型色谱图Fig.2 Typical chromatogram of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole

2.2 不同净化方法的填料

本实验选择GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法，其中GPC按照国家标准(GBT 20772—2008)，使用Bio-BeadsS-X3填料，依靠分子质量(400～14 000)排阻层析，可以很好地去除脂肪等杂质。在SPE和QuEChERS 2种净化方法中，本实验对比了PSA、C18对样品的净化效果，实验结果见图3。可以看出，在均使用无水MgSO4的情况下，SPE和QuEChERS两种净化方法选择PSA与C18协助净化的效果优于单独使用PSA或C18，且样品上机液清透明亮，可以很好地保证噻菌灵和代谢物5-羟基噻菌灵的净化效果，有效避免仪器污染，其原因可能是动物源样品通常含有大量脂肪、蛋白质及非极性磷脂类干扰物等杂质，给噻菌灵及其代谢物带来干扰。C18吸附剂在硅胶上键合了十八烷基官能团，对非极性干扰物具有较好去除效果，PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团，可吸附酸性化合物[22]。当只使用PSA或C18，样品中杂质的净化效果较差，引起目标化合物回收率偏低。将C18和PSA混合使用，在SPE和QuEChERS两种方法均表现出较好的净化效果。但是与SPE法相比，QuEChERS法不需要额外装填萃取小柱，快速、简捷，回收率达到要求，可用于动物源食品中农药残留分析的快速净化处理。

2.3 不同净化方法的回收率

以不含噻菌灵和5-羟基噻菌灵的猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉空白样品，分别在0.01、0.05和1.0 mg/kg 3个质量浓度进行添加回收率实验，测试GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法的准确度，实验结果见表3。GPC法在实验的3个浓度时，5次重复的平均回收率为80%～108%；SPE法在实验的3个浓度时，5次重复的平均回收率80%～110%；QuEChERS法在实验的3个浓度时，5次重复的平均回收率82%～107%。我国农业行业标准NY/T 788—2018农作物中农药残留试验准则中规定，添加水平在0.01、0.05和1.0 mg/kg时，回收率应分别为60%～120%、70%～120%和70%～110%。本实验3种净化方法对噻菌灵和5-羟基噻菌灵的添加回收率均满足要求。

a-SPE法;b-QuEChERS法图3 SPE和QuEChERS使用不同吸附剂对比图Fig.3 Comparison of Purification between SPE and QuEChERS with different adsorbents

表3 噻菌灵与5-羟基噻菌灵在五种动物源食品中的添加回收率及相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole in 5 food products of animal origin (n=5)

2.4 实际样品的检测

为了验证方法在实际样品分析中的适用性，本实验在海口本地市场抽取的猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉样品各30个，使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法进行前处理，并分别配制5种样品的基质标准溶液进行检测，所有样品中均未检出噻菌灵和5-羟基噻菌灵。方法具有良好的灵敏度和的重现性，可满足市场样品检测需求。

3 结论

动物源食品含有大量的脂肪等杂质，尤其是对于猪背膘、猪腩等部位，其脂肪含量可达50%以上，在前处理的净化过程需要进行脱脂及去除其他干扰杂质[23]。本实验中主要测试的样品为猪瘦肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉，脂肪含量较低，PSA与C18协助净化可以达到较好的效果，因此在提取后直接使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法处理。同时，在保证分析方法灵敏度满足需求的情况下，上机液的定容使用较大体积的溶剂，避免因浓缩带来的杂质干扰，大大简化了前处理过程，提高了分析效率。此外，当遇到猪背膘等脂肪含量高的动物源样品，可在提取时加入正己烷进行除油，其对本实验中的非脂溶性农药噻菌灵的提取率影响较小，但对于其它脂溶性农药可能会造成回收率偏低，其影响有待进一步研究。

本实验对比研究GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉等动物源食品中噻菌灵及其代谢物残留测定的净化效果。其中GPC法使用Bio-BeadsS-X3填料，SPE法和QuEChERS使用PSA与C18吸附剂协助净化，3种净化方法在样品分析时的回收率均满足要求。考虑到GPC法和SPE法需要特定的仪器或固相萃取柱，耗时费力，推荐使用快速、简捷的QuEChERS方法进行处理，可用作噻菌灵在动物源食品中的检测分析。