MiR-148b-3p通过调控CDKN1B表达影响心肌细胞增殖及凋亡的分子机制

王嘉明，郭丽敏，郭艳娟，程国良

急性心力衰竭等心血管疾病是临床常见疾病，其发病率高且患者预后较差，已严重影响患者生活质量，研究表明心肌细胞凋亡是引发心血管疾病发生的主要原因之一[1,2]。因而寻找心肌细胞凋亡相关基因或蛋白有助于提高心血管疾病治疗效果及改善患者预后。微小RNA（miRNA）属于内源性非编码单链小RNA分子，其可通过靶向调控下游靶基因表达从而影响细胞增殖、凋亡等生物学行为，研究表明miRNA在心肌细胞中异常表达并可能调控细胞增殖及凋亡等生物学过程[3]。相关报道指出微小RNA-148b-3p（miR-148b-3p）在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中表达上调并可能参与心肌细胞损伤过程[4]。通过生物信息学分析显示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（CDKN1B）可能是miR-148b-3p的靶基因，研究表明CDKN1B表达下调并可能参与成纤维细胞增殖过程[5]。但miR-148b-3p是否可通过调控CDKN1B表达从而影响心肌细胞增殖及凋亡过程尚未可知。既往研究显示脂多糖（LPS）可诱导心肌细胞凋亡并可造成心肌细胞损伤从而促进心血管疾病的发生[6]。因此，本研究采用LPS处理心肌细胞，探讨miR-148b-3p对LPS诱导的心肌细胞增殖及凋亡的影响，分析其对CDKN1B的靶向调控作用，旨在为阐明miR-148b-3p在心肌损伤中的作用机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂大鼠心肌细胞H9c2购自美国ATCC细胞库。杜氏改良培养基（DMEM）、胎牛血清购自美国Gibco公司；LPS购自北京百奥莱博科技有限公司；Trizol试剂、Lipofectamine2000、pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；miR-148b-3p特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-148b-3p）及其阴性对照（anti-miR-NC）、miR-148b-3p寡核苷酸模拟物（miR-148b-3p mimics）及阴性对照mimic NC序列（miR-NC）、CDKN1B小分子干扰RNA（si-CDKN1B）、乱序无意义阴性序列（si-NC）购自上海吉玛制药技术有限公司；甲基噻唑基四唑（MTT）购自美国Sigma公司；膜联蛋白V（annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒购自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液与二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；兔抗鼠CDKN1B抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；兔抗鼠细胞周期蛋白1（CyclinD1）、P21、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam公司。

1.2 LPS处理与实验分组心肌细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，培养条件：37 ℃、体积分数5%CO2，待细胞生长至80%融合度时进行传代培养。收集对数生长期心肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基终止消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于96孔板（100 μl/孔），继续培养24 h，使用含有10 μg/ml的LPS处理H9c2细胞24 h，记作LPS组[7]。同时将正常培养的心肌细胞作为Con组。分别将antimiR-NC、anti-miR-148b-3p、pcDNA、pcDNACDKN1B、anti-miR-NC与si-NC、anti-miR-148b-3p与si-CDKN1B转染至心肌细胞48 h，使用含有10 μg/ml的LPS处理H9c2细胞24 h，分别记作LPS+anti-miR-NC组、LPS+anti-miR-148b-3p组、LPS+pcDNA组、LPS+pcDNA-CDKN1B组、LPS+anti-miR-NC+si-NC组、LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B组。转染方法参照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的表达水平采用Trizol法提取各组心肌细胞中的总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度。参照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，miR-148b-3p正向引物5’-GCGTCAGTGCATCACAGAA CTTTGT-3’，

反向引物5’-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCA GGCGACA-3’；

CDKN1B正向引物5’-CAGACCCGGGAGAA AGATGT-3’，

反向引物5’-CCAAGTCCCGGGTTAACTCT-3’；

U6正向引物5’-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3’，

反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；

GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTA TTG-3’，

反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO4 2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μl；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共40次循环。miR-148b-3p以U6为内参，CDKN1B以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的相对表达量。

1.4 MTT检测细胞存活率收集各组对数期心肌细胞接种于96孔板（3×104个/孔），每孔中加入20 μl MTT，置于37 ℃恒温培养箱内继续培养4 h，4 ℃条件下经3000 r/min离心15 min，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），应用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的相对吸光度值（OD），计算细胞存活率（%）=（各实验组OD值-空白对照组OD值）/（正常对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组对数期心肌细胞，预冷PBS洗涤，4 ℃条件下经3000 r/min离心15 min，弃上清，PBS再次洗涤，相同条件下离心，弃上清，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混匀，加入5 μl PI，充分混匀，室温避光孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪及Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。

1.6 双荧光素酶报告基因检测miR-148b-3p的靶基因TarBase v.8预测显示miR-148b-3p与CDKN1B的3’UTR区存在结合位点，利用基因技术将结合位点进行突变，分别将含有结合位点及突变位点的CDKN1B的3’UTR插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-CDKN1B、突变型载体MUT-CDKN1B，分别将miR-NC、miR-148b-3p mimics与WT-CDKN1B、MUT-CDKN1B共转染至心肌细胞，参照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，转染48 h后收集细胞，按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性。

1.7 蛋白免疫印迹（Western blot）检测CDKN1B、CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达收集各组对数期心肌细胞，加入400 μl RIPA，冰上裂解30 min，4 ℃条件下经12 000 r/min离心10 min，提取细胞总蛋白。采用BCA法检测蛋白浓度，严格按照试剂盒说明书进行操作。蛋白样品中加入上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温条件下使用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入目的蛋白与内参GAPDH蛋白一抗稀释液（1:1000），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀释液（1:5000），TBST洗膜，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用Quantityone软件检测条带灰度值。

1.8 统计学处理所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞中miR-148b-3p与CDKN1B的表达量比较与Con组比较，LPS组心肌细胞中miR-148b-3p的表达水平显著升高（P＜0.05），CDKN1B mRNA及蛋白水平显著降低（P＜0.05）（图1、表1）。

2.2 抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响与Con组比较，LPS组心肌细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与LPS+anti-miR-NC组比较，LPS+anti-miR-148b-3p组心肌细胞存活率显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平显著降低（P＜0.05）（图2、表2）。

图1 Western blot法检测心肌细胞中CDKN1B蛋白表达

表1 心肌细胞中miR-148b-3p与CDKN1B的表达量比较（，n=9）

表1 心肌细胞中miR-148b-3p与CDKN1B的表达量比较（，n=9）

注：CDKN1B：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B

指标 Con组 LPS组 P值miR-148b-3p 1.00±0.12 2.58±0.23* ＜0.001 CDKN1B mRNA 1.02±0.16 0.35±0.08* ＜0.001 CDKN1B蛋白 0.85±0.10 0.42±0.11* ＜0.001

2.3 CDKN1B过表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响与LPS+pcDNA组比较，LPS+pcDNA-CDKN1B组心肌细胞存活率显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平显著降低（P＜0.05）（图3、表3）。

图2 抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响（A：流式细胞术检测细胞凋亡率；B：Western blot法检测细胞增殖及凋亡相关蛋白表达

2.4 miR-148b-3p靶向调控CDKN1B的表达TarBase v.8预测显示CDKN1B的3’UTR中含有与miR-148b-3p互补的核苷酸序列（图4）。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型载体WT-CDKN1B的细胞实验中，与miR-NC组比较，miR-148b-3p组荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；共转染突变型载体MUT-CDKN1B的细胞实验中，miR-148b-3p组荧光素酶活性与miRNC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。与miR-NC组比较，miR-148b-3p组细胞中CDKN1B蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与antimiR-NC组比较，anti-miR-148b-3p组细胞中CDKN1B蛋白水平显著升高（P＜0.05）（图5、表5）。

2.5 沉默CDKN1B可减弱抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的作用与LPS+anti-miRNC+si-NC组比较，LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B组细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平显著升高（P＜0.05）（图6、表6）。

3 讨论

心血管疾病、癌症等多种疾病发生及发展均可能受到miRNA的调控，研究表明miRNA可参与调控心血管疾病氧化损伤过程，还可影响心肌细胞凋亡[8-10]。但仍有部分miRNA在心肌细胞损伤过程中的调控机制尚未阐明。因而本研究积极探寻新型miRNA并分析其在心肌细胞损伤过程中的作用机制。

miR-148b-3p表达上调可通过抑制靶基因DNMT1表达从而影响关节炎的发生[11]。研究表明miR-148b-3p可能作为诊断急性缺血性卒中、心力衰竭等心血管疾病的潜在生物标志物[12,13]。本研究结果显示LPS处理后心肌细胞中miR-148b-3p的表达水平显著升高，提示miR-148b-3p在心肌细胞损伤过程中发挥重要调控作用。细胞增殖与凋亡失衡可引发多种疾病发生及发展，研究表明细胞增殖与细胞周期密切相关，CyclinD1可正向调控细胞周期，促进细胞增殖，而P21可负向调控细胞周期，抑制细胞增殖[14]。细胞凋亡过程受到细胞内抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的调控，Bcl-2属于抗细胞凋亡蛋白，Bax属于促细胞凋亡蛋白，并可通过线粒体途径从而诱导细胞凋亡[15]。本研究结果显示LPS处理后心肌细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，CyclinD1、Bcl-2表达下调，P21、Bax表达上调，而抑制miR-148b-3p表达后可明显减弱LPS对心肌细胞增殖及凋亡的作用。提示抑制miR-148b-3p表达可抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡并促进细胞存活。

表2 抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响（，n=9）

表2 抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响（，n=9）

注：CyclinD1：细胞周期蛋白1；Bax：B淋巴细胞瘤-2相关蛋白；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；与Con组比较，aP＜0.05；与LPS+anti-miR-NC组比较，bP＜0.05

项目 Con组 LPS组 LPS+anti-miR-NC组 LPS+anti-miR-148b-3p组 P值miR-148b-3p 1.01±0.13 2.57±0.16a 2.53±0.18 1.13±0.11b ＜0.001细胞存活率（%） 100.32±13.25 56.48±6.57a 57.65±8.54 87.65±10.03b ＜0.001细胞凋亡率（%） 7.79±0.25 25.64±1.25a 26.54±3.21 10.03±2.15b ＜0.001 CyclinD1 0.87±0.11 0.45±0.08a 0.43±0.10 0.75±0.13b ＜0.001 P21 0.40±0.09 0.89±0.13a 0.90±0.16 0.52±0.11b ＜0.001 Bax 0.46±0.11 0.95±0.18a 0.92±0.17 0.53±0.12b ＜0.001 Bcl-2 0.92±0.16 0.40±0.11a 0.41±0.13 0.82±0.15b ＜0.001

表3 CDKN1B过表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响（，n=9）

表3 CDKN1B过表达对心肌细胞增殖及凋亡的影响（，n=9）

注：CyclinD1：细胞周期蛋白1；Bax：B淋巴细胞瘤-2相关蛋白；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2

项目 LPS+pcDNA组 LPS+pcDNA-CDKN1B组 P值CDKN1B蛋白 0.45±0.13 0.96±0.15* ＜0.001细胞存活率（%） 58.67±10.36 89.67±11.32* ＜0.001细胞凋亡率（%） 25.47±3.16 8.95±1.13* ＜0.001 CyclinD1 0.46±0.11 0.80±0.20* ＜0.001 P21 0.91±0.18 0.42±0.09* ＜0.001 Bax 0.90±0.13 0.42±0.08* ＜0.001 Bcl-2 0.43±0.15 0.85±0.17* ＜0.001

图3 Western blot法检测细胞增殖及凋亡相关蛋白表达

图4 TarBase v.8预测miR-148b-3p与CDKN1B结合示意图

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）

注： WT-CDKN1B：野生型载体，MUT-CDKN1B：突变型载体

项目 miR-NC组 miR-148b-3p组 P值WT-CDKN1B 1.02±0.13 0.43±0.10* ＜0.001 MUT-CDKN1B 1.08±0.16 1.10±0.18 0.806

图5 Western blot法检测CDKN1B蛋白表达

CDKN1B在肝细胞癌、骨肉瘤等多种癌症中表达异常并可参与肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学过程[16-18]。本研究结果显示LPS诱导的心肌细胞中CDKN1B的表达下调，进一步分析显示CDKN1B过表达后可明显抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡，并可提高细胞存活率，提示CDKN1B过表达可促进心肌细胞存活及抑制细胞凋亡。本研究通过双荧光素酶报告实验与Western blot实验证实miR-148b-3p可靶向结合CDKN1B并可负向调控CDKN1B的表达，提示miR-148b-3p可能通过靶向CDKN1B促进心肌细胞凋亡及抑制细胞增殖。为探讨miR-148b-3p是否可通过调控CDKN1B表达从而影响心肌细胞增殖及凋亡，本研究将anti-miR-148b-3p与si-CDKN1B共转染至心肌细胞，结果显示细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低，P21、Bax蛋白水平升高，提示抑制miR-148b-3p表达可能通过上调CDKN1B表达从而促进心肌细胞增殖及抑制细胞凋亡。

表5 miR-148b-3p调控CDKN1B的表达（，n=9）

表5 miR-148b-3p调控CDKN1B的表达（，n=9）

注：CDKN1B：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B；与miR-NC组比较，aP＜0.05；与anti-miR-NC组比较，bP＜0.05

项目 miR-NC组 miR-148b-3p组 anti-miR-NC组 anti-miR-148b-3p组 P值CDKN1B蛋白 0.75±0.16 0.32±0.05a 0.71±0.11 0.98±0.10b ＜0.001

图6 Western blot法检测细胞增殖及凋亡相关蛋白表达

表6 沉默CDKN1B可减弱抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

表6 沉默CDKN1B可减弱抑制miR-148b-3p表达对心肌细胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

注：CyclinD1：细胞周期蛋白1；Bax：B淋巴细胞瘤-2相关蛋白；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2

项目 LPS+anti-miRNC+si-NC组LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B组P值CDKN1B蛋白 0.97±0.12 0.41±0.10* ＜0.001细胞存活率（%） 86.65±11.25 43.25±10.03* ＜0.001细胞凋亡率（%） 10.16±1.58 26.57±2.16* ＜0.001 CyclinD1 0.83±0.16 0.44±0.12* ＜0.001 P21 0.52±0.11 0.97±0.13* ＜0.001 Bax 0.53±0.12 0.96±0.18* ＜0.001 Bcl-2 0.78±0.15 0.42±0.11* ＜0.001

综上所述，LPS诱导的心肌细胞中miR-148b-3p呈高表达，CDKN1B呈低表达，抑制miR-148b-3p表达可能上调CDKN1B表达从而抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡，促进细胞增殖，其作用机制可能与调控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达有关，miR-148b-3p可能成为诊断及治疗心血管疾病的潜在靶点。