呼吸道九联检、血清降钙素原联合痰培养与药敏分析在小儿急性呼吸道感染诊治中的应用

陈华俊

（防城港市第一人民医院，广西壮族自治区 防城港 538021）

0 引言

小儿急性呼吸道感染是由细菌、病毒以及其他非特异性病原体引起的气管、支气管及肺部感染性疾病，是小儿住院的常见疾病之一。如不及时诊治，会导致呼吸系统症状倾向性地延续到成人并发展为慢性疾病[1]，因此，快速准确的区分不同病原体感染并提供相对应的药敏试验及用药后疗效观察的实验室指标，对于小儿急性呼吸道感染的诊治尤为重要。本文将对呼吸道感染病原体的检测方法及炎性指标进行分析，综合论述呼吸道九联检、血清降钙素原联合痰培养与药敏分析在小儿急性呼吸道感染诊治中的应用价值。

1 呼吸道感染病原体的检测方法

近年来，随着新的致病性病原体不断的发现，相应的检测方法也在不断的更新，为临床呼吸道疾病的诊治提供了有力的依据。目前常见呼吸道病原体的检测方法包括。

1.1 病原体分离培养

痰液的病原体培养主要用于呼吸道感染的病因诊断，合格的痰标本要求白细胞数>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，或白细胞/鳞状上皮细胞>2.5/1。定量培养菌量≥107cfu/mL可判定为致病菌。细菌培养一般选用血平板、巧克力平板、中国蓝/麦康凯培养基。

病毒分离培养法目前仍是病毒鉴定的经典方法。病毒分离培养方法分为三种：动物培养、鸡胚培养和组织细胞培养。组织细胞培养因为操作相对简单、成本相对较低而被广泛采用。病毒培养常选用猴肾或人胚肾细胞、二倍体细胞株、Hela、HepG2细胞、犬肾传代细胞和鸡胚接种，如：流感病毒常采用MDCK细胞分离，腺病毒和呼吸道合胞病毒采用HEP2细胞分离等[2]，通过电子显微镜、细胞病变效应、凝血实验、凝血抑制实验、中和实验和空斑形成实验进行鉴定。

传统病原菌培养方法费时，其检测时间为4-5天，且有的病原菌生长缓慢、有的是苛养菌、有的病原菌极难培养、还有少数无法培养或者致病力很强的病原菌。病毒培养由于实验条件要求较高，培养周期较长且操作繁琐，在普通实验室应用受限。但现阶段，临床主要采用半自动及自动化微生物分析系统进行痰检验，自动化程度更高，覆盖病原菌面积更宽，准确快速鉴定病原菌的同时，报告结果更完整，包括药物敏感性，临床可通过药敏试验选择合适的抗菌药物。病原菌分离培养是鉴别呼吸道病原菌类型的金标准，因此，痰培养仍有不可取代的地位。

1.2 血清学检测

血清学检查是诊断呼吸道病原体感染的主要手段。其检测机理主要是通过已知的标准抗原或由患者标本分离出的新病原作为抗原与患者血清结合产生抗原抗体反应，在临床诊断和流行病学的调查中普遍使用。

1.2.1 血凝抑制试验

某些呼吸道病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，当存在血凝素特异性抗体时，可阻止血细胞发生凝集，称为血凝抑制(HemagglutjnationInhibition，HI)。血凝抑制试验用于流感、副流感、肠道病毒、腺病毒的检测中，微量法血凝抑制试验是WHO在流感监测工作中推荐使用的标准方法。该方法影响因素为病毒表面的特异性红细胞抑制物质，所需病毒较多。

1.2.2 中和实验

用已知抗体血清和待测病毒悬液混合，室温下作用一段时间后接种敏感细胞，经培养后观察细胞病变效应或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体能否中和相应病毒的感染性。

1.2.3 固相膜免疫实验

利用硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜和尼龙膜等作为载体,金元素、硒元素和酶促底物置于载体上，抗原和抗体通过穿流或横流的形式在载体上反应 ,常用的实验方式有免疫层析实验、免疫渗滤实验、酶联免疫斑点实验、免疫印迹法等。呼吸道病原体的抗原或抗体皆可通过此方法检测 ，但因其特异性较差，且易受血清质量的影响，因此应用并不普遍。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

用已知的抗原 (抗体)包被在聚苯乙烯微孔上，和待测的抗体(抗原)、酶标的抗原(抗体 )进行反应，通过洗涤分离，继而加入酶促底物显色，根据呈色的强弱，判定待测物的有无或多少。该方法是临床实验室通过检测抗原抗体诊断病原体感染应用最广泛的技术，ELISA方法操作简单，2-3h即可获得检测结果，不需要昂贵的仪器，适合于大批量标本检测，灵敏度和特异性较好。但ELISA检测结果易受许多因素影响，如标本中抗原浓度太高可能导致假阴性；血清中非特异性IgG浓度高或含有类风湿因子，或固相包被的抗原纯度不够，则可能导致假阳性结果。

1.2.5 化学发光免疫分析法(Chemiluminescence Ⅰmmunoassay,CLIA)

化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，是继放射免疫分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。如果将化学发光物质 (如吖啶酯)直接用于标记抗原或抗体，称为化学发光标记免疫分析，如果采用酶 (辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)标记抗原或抗体 ，将化学发光物质作为酶的底物 (鲁米诺，金刚烷)，称为化学发光酶免疫分析。赵宗瑞等采用磁微粒化学发光检测呼吸道合胞病毒IgM抗体，该方法及试剂精密性良好，与临床诊断标准符合率较好[3]。化学发光法具有高灵敏度、高特异性、快捷方便等特点，但一般需大型仪器设备，成本较高，因此，此法用于呼吸道病原体的检测并不广泛。

1.2.6 免疫荧光技术(荧光抗体技术)

免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种的技术，目前受到较多关注[4]。该技术建立于免疫学、生物化学和显微镜技术的基础之上。利用荧光素(异硫氰酸荧光素)标记抗体，用荧光显微镜观察有无显荧光的抗原抗体复合物存在。测定方式分为直接法和间接法，间接法的敏感度比直接法高5~10倍。该方法是呼吸道病原体，特别是新发高致病性病原体检测的常用方法。呼吸道九联检的基本原理，是用间接免疫荧光法确定呼吸道感染患儿血清标本中的特异性IgM抗体。IgM抗体是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，是初次体液免疫应答中最早出现的抗体,提示新近发生感染，是近期感染的一个有效标志物。呼吸道九联检是用间接免疫荧光法检测呼吸道肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒共 9种呼吸道病原体IgM 抗体。该方法是无放射性污染，具有高度的特异性、敏感性，操作简便、快捷，可同时检测九种病原体，覆盖面广，成本低，只需配备相应的荧光显微镜，无需大型仪器设备，易于推广，其对小儿急性呼吸道感染的诊治指导性强[5-7]。

1.3 分子生物学(核酸扩增法)

核酸扩增法主要是通过指定的DNA引物片段扩增检测相应病原体的DNA，其特点是具有高效的特异性、敏感性，对多种病原体的检测普遍有效。其中聚合酶链反应(PCR)就是一种行之有效的检测手段，对不易培养和不适合在培养基上生长的病毒可使用 PCR检测技术。PCR检测技术在过去十几年里飞速发展，已广泛应用于临床实验室的常规检测，因此利用核酸检测技术已成为呼吸道病原体体外诊断的新方向。核酸检测技术在保证高灵敏度和特异度的基础上，大大缩短了检测时间，国际上围绕其建立了多种较为成熟的呼吸道病原体检测方法。

1.3.1 实时荧光定量PCR

以传统PCR技术为基础发展起来的实时荧光定量PCR，使核酸检测从定性分析发展到定量分析，开创了核酸检测分析的新局面。目前，实时荧光定量PCR已成为呼吸道病原体核酸检测的最主要方法。相对于传统PCR，荧光定量PCR检测呼吸道病原体有如下优点：①定量检测可随时监控病毒扩增情况；②建立了一个封闭式反应检测环境，大大减少了交叉污染的可能性，同时具有很高的灵敏度及特异度，且所需标本量极小；③检测时间较传统PCR短。

1.3.2 多重PCR技术

多重PCR是在同一PCR体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR，一次多重PCR可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特的优势和很高的实用价值。如王玉月[8]等报道的九种常见呼吸道病原体副流感病毒 1、2、3型、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的检测。近年来，多重荧光定量PCR已成为呼吸道病毒检测的研究热点。该方法在一个反应体系中可同时实现定量检测和高通量检测的目的。Fang等[9]利用一步多重实时定量PCR法可同时检测乙型流感病毒，甲型 H1N1、H3N2、H5N1流感病毒，其检测灵敏度可达101~102copies/mL体外转录RNA。436例咽拭子标本的阳性检出率达59.86%(261/436)，同时用病毒分离培养法进行复检，其阳性检出率仅为43.35%，这也说明多重实时定量PCR的灵敏度要高于传统的病毒分离培养。

1.3.3 靶序列富集多重PCR技术

该技术的原理是首先利用低浓度的靶序列特异性引物经巢式PCR扩增富集目标序列，然后引入一对高浓度的通用超级引物对目标序列进行大量扩增，并在此过程中以生物素标记PCR产物。该技术能在一次反应中对多种靶序列进行高度敏感和特异的扩增与检测并实现对所有目标序列进行均匀、同效率的扩增。此外，Han等将靶序列富集多重PCR的多重扩增技术和液相芯片检测技术有机结合，建立了常见呼吸道病原体的分子鉴别诊断平台，将扩增的高效性和检测的高效性相结合，非常适合于对多种病原体核酸的快速检测。王鑫磊等[10]报道了鲍曼不动杆菌等14种病原体的检测。

1.3.4 恒温扩增芯片法

利用具有链置换功能的聚合酶在恒温(65℃)条件下进行反应,使用荧光染料掺入法进行实时荧光检测。扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线,进一步完成对靶基因的扩增和检测。该方法具有特异性和敏感性更高、试剂耗量低、病原体覆盖面广等优势,具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能[11-14]。康蓓佩等[15]报道了对13种常见呼吸道感染病原体包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等的检测。

1.3.5 悬浮阵列技术

该技术采用靶序列富集多重PCR结合多功能悬 浮阵列检测平台对毒进行定量分析。由于该技术开始仅使用少量的特异性引物扩增，随后经超级引物进行大量的放大，提高了敏感度和特异度，基本实现了对所有目标片段以相同的效率进行扩增，从而达到对多种病毒核酸定量检测的目的。xTAG检测板技术也属于悬浮阵列技术。FDA可同时检测和鉴定12种特定呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒检测板。xTAG是首个批准上市的可同时检测和区别A型流感病毒H1和H3亚型的呼吸道病毒检测板，同时也是首个被用于检测确定的人类偏肺病毒检测板。

核酸扩增法敏感性强、特异性高，在呼吸道病原体的核酸检测中具有较高的实用价值，但其对大量不同的病原体快速检测和鉴别的能力较差。另外其缺点还在于运用的检测仪器昂贵，对检测空间、环境等条件和操作技术人员的要求相对较高，且需要验收及准入才可以开展该项目的检测，因此该方法的推广，特别在基层医院的应用受到了一定的限制[16]。

2 呼吸道感染的炎性指标

呼吸道感染病原体在体内繁殖或产生毒素，诱发呼吸道感染的发生和发展，随着病原体及其代谢产物不同程度的扩散，引发炎症或器官功能障碍。快捷有效的炎性监测指标有利于临床采取相应的抗感染治疗，影响患者的预后，对临床具有重要价值。目前临床常用的炎性指标主要包括以下几类。

2.1 白细胞（WBC）计数及分类

WBC是外周血的有核细胞，通过不同方式不同机制消灭病原体，参加免疫反应，产生抗体，是机体抵抗病原微生物等异物入侵的主要防线，所以临床多用WBC计数及分类作为诊断和鉴别感染类型的常规指标。其增高见于大部分化脓性细菌引起的感染，减少见于病毒性感染，病毒性感染时常将淋巴细胞计数作为参考指标。白细胞计数及分类检测速度快，价格低廉，容易被患者接受。但是人体血液中WBC基础值个体差异大，且WBC总数易受运动、日间变化、精神、药物等多种因素影响，所以WBC计数用于病原体感染性疾病的诊断敏感性不够，单凭借血常规的变化作为诊断病原体感染的依据具有一定局限性。

2.2 C反应蛋白（CRP）

CRP是人体肝脏细胞所合成分泌的一种急性时相反应蛋白，是临床上运用较为广泛的感染诊断指标之一，在机体受到多种感染或组织细胞受损等非感染因素时，均可引起CRP升高，并且上升较为迅速，在炎症反应发生后的5-8h就有可能呈现出来。在评价感染所致的炎症反应方面，CRP不仅可作为败血症预示和预后的指标，还常用来帮助鉴别细菌和病毒感染。正常情况下CRP在人体血液中含量甚微，而在细菌感染、炎症、组织损伤、手术创伤等应激状态下显著升高。研究显示急性损伤和感染后6-12h CRP即可明显升高，36-50h达峰值，最高可至百倍及1000倍以上[17]，且与炎性反应和组织损伤的程度呈正比，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中也指出多数患者外周血CRP升高，其进行性上升是重型、危重型患者的临床预警指标。大多数病毒感染的患者值较低，<2~4mg/L，但在部分病毒感染（尤其是病毒性脑膜炎患者）时其水平可有较明显上升。目前CRP已经作为医院急诊常规检测项目，是诊断全身细菌性感染的重要标志物，动态观察CRP可作为细菌感染合理使用抗生素、疗效及治愈判断的指标。陈锐等[18]的研究显示，小儿急性呼吸道感染早期阶段，CRP水平增高,接受相应治疗后逐步降低,提示CRP可作为判定急性呼吸道感染程度的主要指标之一。但由于CRP在细菌感染初期血清升高不明显，不利于临床做出快速诊断，且在心血管疾病、创伤等状态下也可升高，因此，CRP对感染缺乏特异性。

2.3 血清淀粉样蛋白A（SAA）

SAA是一个高度异质性蛋白，由肝细胞产生，其核心的临床价值在于对病毒性感染的鉴别，可作为诊断病毒、细菌感染的敏感指标。在细菌感染性疾病中，SAA的敏感性高于CRP，上升早、幅度大，尤其是在急性细菌感染早期，检测SAA的优势更加显著；在病毒感染性疾病中，SAA显著升高，根据其升高的程度或与其他指标联合运用，可以提示细菌性或病毒性感染，弥补了目前常用炎症标志物不能提示病毒感染的不足。SAA作为新一代出现的炎症感染指标，联合CRP、血常规的诊断，是判断病毒感染，监测病程及用药疗效的优选血清学指标。应当注意的是，SAA是非特异性的炎症标志物，需要在结合临床其他证据的前提下，进行相应的临床诊断。

2.4 红细胞沉降率（ESR）

ESR反映的是红细胞的沉降速度，实质为血浆纤维蛋白原和免疫球蛋白的聚集，是一种非特异性的检查指标。当机体发生炎性反应时，ESR在2~3 d后即会出现升高，其原因可能为：急性细菌性感染时，血中α1胰蛋白酶、α2巨球蛋白、CRP、转铁蛋白、纤维蛋白原等增多，这些炎性反应趋化物均可导致红细胞聚集，从而使红细胞沉降加快，ESR数值增加，有时高达100 mm/h以上，因此临床上将其作为疾病是否在活动期的检测指标。ESR在炎性反应控制后，下降速度较慢，一般需要几周时间才能正常，且易受到年龄、性别、红细胞数量、个体大小、温度、抗凝剂多少等的影响，特异性和敏感性低，临床应用存在局限性。

2.5 白介素 6（IL-6）

IL-6是一种具有多种生物活性的细胞因子，由212个氨基酸残基 组成，主要参与急性期炎症反应。在感染、应激与创伤等刺激下由活化的T细胞、B细胞及巨噬细胞等大量分泌。IL-6可对内皮细胞与炎性细胞产生直接的激活作用，可加速炎症反应的速度，对组织器官造成损害。IL-6参与许多疾病的发生和发展，炎症、病毒感染、自身免疫疾病等均可导致其血清水平升高，而且它的变化比CRP更早，细菌感染时IL-6迅速升高，PCT在2h后增加，而CRP在6h后才迅速增加，因此可用来辅助急性感染的早期诊断。有研究表明，在临床症 状出现前2d，血液中IL-6水平已大幅增加，故早期阳性率较高，对于早期评估感染严重程度具有重要价值[19]。此外，IL-6水平与患者感染严重程度和预后密切相关，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中指出外周血炎症因子IL-6进行性上升是重型、危重型的临床预警指标，因此动态观察IL-6水平有助于了解感染性疾病的进展和对治疗的反应。

2.6 降钙素原（PCT）

PCT作为血清降钙素(CT)的前肽物质，由甲状腺 C细胞分泌产生 ，是一种由116个氨基酸组成的糖蛋白。与传统的炎症指标 WBC、CRP等比较，PCT在感染发生仅2h后即可提示系统感染的存在，并能区分细菌感染还是病毒感染。炎症反应释放的 PCT 可以被细菌毒素如内毒素直接诱导产生，也可由细胞介导的宿主反应如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6间接诱导产生，但此诱导过程可以被病毒感染时机体释放的细胞因子和干扰素阻断，所以病毒性感染患者的PCT水平一般都很低。当患者出现细菌、真菌感染时，机体的降钙素原水平会出现明显的上升。但在病毒感染与非感染性炎症反应时机体的降钙素原水平仅会出现轻度上升或无显著变化。细菌性肺炎患者的PCT水平高于病毒、不典型病原体（军团菌除外）和结核菌导致的肺炎，PCT水平与肺炎的严重程度呈正相关，其鉴别病毒性疾病的敏感性和特异性均高于传统标志物（WBC、CRP、ESR等）。可见，PCT对细菌性及非细菌性感染具有早期诊断及鉴别诊断的价值[20]。

连续监测PCT水平有助于了解患者的感染情况，指导运用抗生素。目前，国内外许多学者就PCT在血清中的浓度指导使用抗生素进行了一系列的研究，并形成了一整套PCT指导抗生素使用的治疗策略[21]。可减少抗生素的使用比例和时间，减少抗生素的滥用，减少耐药菌群的产生[22-23]。PCT含量反映了细菌感染的程度并作为评价病情严重程度的重要指标之一，目前，国内外部分医院依据PCT检测结果对小儿急性呼吸道感染患者合理应用抗生素：当PCT<0.25ng/mL,不主张应用抗生素；而PCT≧0.5ng/mL，则主张针对性应用抗生素。因此，血清PCT检测，能为临床对患儿早期诊治和合理用药提供重要依据。

3 总结

综上所述，小儿急性呼吸道感染的病原体及炎性指标检测的方法层出不穷，各有优缺。引起小儿急性呼吸道感染常见病原体种类有病毒、支原体、衣原体和细菌等，对药物敏感性各不同。因此，确定病原体种类是个体化治疗的依据。病原体检测的方法有病原体分离培养及鉴定、血清学试验、核酸检测等[24]。病原体分离培养及鉴定是诊断 呼吸道感染的金标准，痰培养与药敏分析鉴定是呼吸道感染常用的病原体检测方法,仍有其不可取代的地位。核酸检测成本、设备和人员要求高，基层实验室难普及，且检测病原体特异性抗原易受采集标本质量的影响，阳性率低于病原体分离培养[25]，因此存在一定的漏诊风险。血清学检测中，呼吸道九联检病原体IgM抗体检测较其他血清学检测方法具有简便、快捷、经济，特异性高等优点，已广泛应用于小儿急性呼吸道感染的诊断中。在呼吸道感染炎性指标中，PCT、CRP、IL-6水平的变化较其他炎性指标对于早期判断急性上呼吸道感染患儿是否为细菌感染更有指导意义，同时还可作为评估预后的指标。研究表明，PCT、CRP、IL-6的敏感度与特异度均较高，但PCT的敏感度与特异度相对更高,且阳性与阴性预测率均明显高于其他两项 ，动力学研究表明，PCT、IL-6和CRP在机体感染时出现的时机不同，PCT早于CRP，但晚于IL-6，同时PCT峰值更宽，消退更缓慢。且PCT的约登指数较其余两项炎症标志物相比有明显增加，表明PCT对细菌感染性疾病的诊断价值明显优于其余两项，PCT作为判断是否为细菌感染的指标特异度更好，真实度更高[26-28]。总之，PCT对诊断细菌性和非细菌性感染有重要价值。但细菌性感染是否合并病毒或支原体等的感染，非细菌性感染中病毒和支原体等的鉴别，还需做IgM抗体检测, 临床的治疗仍需病原体的鉴定与药敏分析作为参考依据。因此，病原体分离培养中的痰培养与药敏分析、血清学检测中的呼吸道九联检及炎性指标中的降钙素原联合检测应用，对小儿急性呼吸道感染的诊断和治疗具有重要的参考价值。