秋茄叶片愈伤组织诱导研究

池上评,梁光红,江传阳,华伟平

(1.福建省林业勘察设计院，福建 福州 350003；2.福建农林大学林学院，福建 福州 350005；3.福建省晋江坫头国有防护林场，福建 泉州 362246；4.武夷学院，福建 武夷山 354300)

1 引言

秋茄(Kandeliacandel) 是我国东南沿海的珍贵木本植物群落——红树林(Mangrove)的主要造林树种[1]，具有重要保护价值。因为红树林对调节全球的气候变化具有十分重要的意义[2,3]，又因其具有丰富的生物量而具有巨大的生态价值[4，5]；同时，完整的红树林不仅可以为人类提供良好的游憩场所，又是一个药源宝库，因此具有很高的社会价值和经济价值[6，7]。目前秋茄的自然分布北界位于福建北部，纬度为27°20′N ，浙江温州有少量人工栽培[8～10]。一般采用胚轴(胎生苗)直接插植进行繁殖，不仅繁殖方式单一，还存在繁殖周期较长、效率低、可控性差、人工移植成活率低、成本高及不易大面积推广等系列问题。随着组织培养技术在林业上的应用[11]，研究如何利用组织培养这一技术来解决秋茄扩大繁殖的问题是十分有意义的。目前，对于秋茄的组织培养的相关报道还很少，2007年黄有军以秋茄顶芽和幼叶为外植体研究了光照和黑暗条件下，不同激素配比对愈伤组织形成的影响[12]。结果表明，外源生长素对秋茄的幼叶愈伤组织形成是必需的，1mg/L2, 4-D 或4mg/L以上的NAA 对愈伤组织形成有较好作用。本实验通过建立红树秋茄的愈伤组织体系，一方面可以对其种质资源进行离体保存，有利于深入保护和开拓红树林植物种质资源的遗传多样性；同时为建立再生体系，实现快速繁殖奠定基础，以最终满足沿海防护林建设的生产要求。对于发展与保护红树林资源、促进红树林生态环境的良性循环都具有重要理论和现实意义。

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

选自福建省晋江坫头国有防护林场红树植物秋茄的幼叶作为外植体进行组织培养。

2.2 试验方法

2.2.1 秋茄愈伤组织形成

对新鲜的外植体进行挑选，取其嫩叶，将外植体在洗洁精溶液中浸泡5 min，自来水冲洗2 h，在无菌条件下将外植体置于75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗一次；然后用0.2%升汞溶液消毒8 min，无菌水漂洗4～5次，切取约9 cm2大小的叶块接种在不同激素配比的培养基上进行愈伤组织的诱导。定期观察叶片愈伤组织的诱导和生长情况。

2.2.2 不同激素配比对秋茄愈伤组织形成的影响

以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的外源生长素：2,4-D、细胞分裂素6-BA作激素配比完全试验，其中，pH值为5.8。置于25 ℃，完全黑暗条件下培养。每处理接种20瓶。培养20 d、30 d、40 d后，观察记录愈伤形成情况，并记录叶片诱导数，计算诱导率(表1)。

表1 对秋茄愈伤组织诱导的不同激素配比

2.2.3 对秋茄叶片诱导愈伤组织的最佳培养基筛选

在通过不同激素配比对愈伤组织形成的影响试验来初步筛选出合适的激素配比的基础上，进一步筛选出较高效的激素配比。同样以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的外源生长素：2,4-D、细胞分裂素6-BA作激素配比完全试验，并加入琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L， pH值为5.8。置于25 ℃，完全黑暗条件下培养。每处理接种20瓶。培养20 d、30 d、40 d后，观察记录愈伤生长状况，并记录叶片诱导数(表2)。

表2 筛选诱导愈伤组织的最佳培养基的激素配比

2.2.4 不同消毒时间对秋茄嫩叶消毒效果的影响

不同消毒时间对秋茄嫩叶、茎尖等消毒效果的影响：分别比较0.2%升汞溶液消毒8 min、3 min+5 min、10 min、4 min+6 min对消毒效果(污染率)以及成活率的影响。其中，“+”为消毒时间间隔，时间为2 min。将外植体切成适合大小，接种于MS培养基中。每处理接20瓶，每瓶接4个叶块。培养20 d后，观察、记录。

成活率=成活数(瓶)/接种数(瓶)×100%

污染率=污染数(瓶)/接种数(瓶)×100%

2.3 培养条件

培养室温度为(25 ± 2) ℃，培养室的相对湿度保持在70%～80%水平，光强为1000～1500 lx，每天光照时间12 h，暗处理则以报纸或牛皮纸覆盖。

2.4 数据统计分析

全文数据采用excel软件进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 愈伤组织形成

接种20d 后在切口处略能看到愈伤组织，呈淡绿色；30d 左右愈伤组织逐渐明显，松散，呈淡黄色；40d左右愈伤组织呈淡黄色，且不再扩大。约60d 愈伤组织开始变成黄褐色(图1)。

图1 愈伤组织的形成

2.2 不同激素配比对愈伤组织形成的影响

由表3可知，不加激素条件下，外植体在基本培养基上培养不能形成愈伤组织，仅施加外源细胞分裂素(BA) 而无外源生长素，同样不能形成愈伤组织，而在施加外源生长素的前提下，BA在一定的水平下，愈伤组织均可发生,说明外源生长素对秋茄树幼叶的愈伤组织形成是必需的。2, 4-D 能诱导愈伤组织的形成，2, 4-D 1 mg/ L 较0. 5 mg/ L 有更好的诱导率，如培养基处理11诱导率比处理7 高，处理10比处理6高，处理12比处理8高。当2, 4-D 浓度提高到2 mg/ L 时诱导率下降。在不添加外源BA 的前提下处理14的愈伤组织能够发生，但形成率不高；而添加了外源BA 后，形成率有一定程度提高，其中处理15最高，达10 %。当BA 浓度达4 mg/ L 时，愈伤组织形成率有所下降，说明一定浓度的BA 在愈伤组织形成过程中有增进作用，但浓度不能过高。

表3 不同激素配比对愈伤组织诱导的结果

3.3 对叶片诱导愈伤组织的最佳培养基筛选

由表4可知，在通过不同激素配比对愈伤组织形成的影响试验来初步筛选出合适的激素配比的基础上，进一步筛选出较高效的激素配比。其中，处理4激素配比的诱导率最高达到40%，较其它激素配比都较高，且与表1所得结论相符，得到叶片诱导愈伤组织的最佳激素配比：MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA。

表4 愈伤组织诱导的最佳培养基筛选

3.4 不同消毒时间对秋茄幼叶消毒效果的影响

由表5可知，用0.2%升汞溶液对外植体进行连续的8 min处理的成活率最高，达到65%，污染率最低，为35%；此外，对外植体依次进行3 min+5 min、4 min+6 min、10 min处理的成活率由高变低，依次为55%、50%、45%，污染率由低变高，依次为45%、50%、55%。说明用0.2%升汞溶液对外植体进行消毒时间不能过长，而且在合适的时间内连续消毒会比间隔、多次消毒效果较好。

表5 不同消毒时间对秋茄幼叶消毒效果的影响

4 讨论

4.1 秋茄愈伤组织形成条件

本试验表明：幼叶可以作为红树秋茄组织培养的外植体。同时，在挑选外植体材料时，要求所挑选的材料要尽量选取叶片的幼嫩部位，且无机械损伤，防止其在试验的消毒过程中消毒剂伤害到外植体的细胞，使外植体在诱导愈伤的过程中容易发生褐变[13]。

4.2 外源物质对秋茄愈伤组织的形成的影响

外源生长素对秋茄的幼叶愈伤组织形成是必需的，这与银杏愈伤组织诱导一致[14]。本试验通过筛选，得到对叶片进行愈伤组织诱导最佳激素配比为MS+1 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA。即当2, 4-D 浓度在1 mg/ L 时有较高的愈伤组织诱导率，添加一定量的外源BA 有助于提高愈伤组织诱导率，但过高的外源BA 则抑制愈伤组织的发生。据报道[15～17]，外源物质活性炭在组织技术上具有广泛的应用，特别是用活性炭来预防外植体褐变的发生具有重要的作用[18]，值得在今后的深入研究。

4.3 试验消毒和操作方法的讨论

秋茄嫩叶消毒时间连续进行8min的成活率最高，污染率最低。组织培养对于试验操作环境要求很高，在进行组织培养的过程中，要保持操作环境始终在无菌环境下；同时，实验员在试验操作过程中应该要严格遵守实验室准则和试验操作流程规则，保持优良的试验环境及对试验操作平台和仪器进行严格的消毒，特别注意操作人员的操作手的消毒；此外，试验操作人员要注意一些实验操作技巧，培养自己的试验操作风格，以降低试验污染率。