羊角脆甜瓜果皮细胞形态及色素分布显微观察

王佳豪 乜兰春 赵文圣 葛畅 段雅倩

摘    要：羊角脆甜瓜为青县地理标志性产品，但其果面常出现瘤状凸起及绿色、黄色或黄绿色斑块现象，影响果实外观品质。为了解其果皮组织结构、细胞形态及色素分布，利用徒手切片和石蜡切片技术对不同发育阶段果实的果皮进行了显微观察。结果表明，授粉至授粉后5 d外果皮细胞呈矩形且排列紧密，中果皮为排列无规则的圆形细胞，授粉5～15 d外果皮和中果皮细胞迅速增大，形状和排列发生明显改变，授粉15 d至果实成熟，外果皮和中果皮细胞形状和排列不再发生明显改变。瘤状凸起果实自外表皮30层以下的细胞长轴极显著高于正常果实，且部分椭圆细胞长轴走向变为垂直于表皮切线，大量此类细胞在局部积聚造成果实表面异常瘤状凸起。正常成熟果实自外果皮10层以下的薄壁细胞存在叶绿素，而10层以内细胞无色素，果皮呈灰白色;果皮上的绿斑是因为外果皮10层以内细胞出现了叶绿素;黄斑则是因为外果皮细胞间出现了黄色色素物质;两种情况发生在同一区域时，果皮出现黄绿色斑块。

关键词：羊角脆甜瓜;果皮;色素分布;细胞形态

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）12-096-05

Abstract： Yangjiaocui melon is the leading melon variety cultivated in Qingxian County. The commodity quality of the fruit was often affected by the appearance of tumours like bulges， green， yellow or yellow-green colour spots on the surface of the fruit. To study the cell morphology and pigment distribution of fruit peel， freehand section and paraffin section techniques were performed at different developmental stages. The results showed that the exocarp cells were rectangular and closely arranged， while the mesocarp cells were rounded and irregularly arranged from 0 to 5 days after pollination. The exocarp and mesocarp cells grew rapidly and significantly changed shapes and arrangement during 5-15 days after pollination. From 15 days after pollination to fruit ripening， there were no significant changes in exocarp and mesocarp cells shapes and arrangement was observed. The long axis of cells in the tumour-like bulges fruit from the outer epidermis below 30 layers was significantly higher than that in the normal fruit， and the long axis of some cells became perpendicular to the epidermal tangents， a large number of such cells locally accumulated can cause the problem of tumor-like bulges. In mature fruits， chlorophyll usually existed in parenchymatous cells below 10 layers of exocarp， and there was no pigment within 10 layers’ cells. Therefore， the fruit peel was an off white colour. The green spots on fruit peel were due to the appearance of chlorophyll in the cells within 10 layers of the exocarp， and the yellow spots resulted from the presence of yellow pigment among intercellular space in exocarp cells. When both of two above mentioned cases occurred at the same area， the yellow-green patches appeared in fruit peel.

Key words： Yangjiaocui melons; Pericarp; Pigment distribution; Cell morphology

甜瓜在我國栽培历史悠久，种植广泛，截止到目前我国已连续30余年成为世界上甜瓜种植面积最大、产量和栽培品种最多的大国[1-2]，羊角脆属薄皮甜瓜，青县羊角脆为国家地理标志产品、河北省特色优势农产品，在河北沧州青县已有千年以上的栽培历史。目前，在青县及周边县市种植面积近7000 hm2[3]。羊角脆甜瓜果实形似羊角，甜脆爽口，是夏季消暑的佳品，深受消费者喜爱[4]。其成熟果实为灰白色，但实际生产中，果面常有绿色、黄色或黄绿色斑块，还有一些果实果面出现瘤状凸起，严重影响果实外观品质，了解果皮细胞形态以及色素分布对解决以上问题具有重要意义。前人对厚皮甜瓜、西瓜果皮组织结构做过一些研究，吴贝等[5]观察京蜜11薄皮甜瓜授粉后0～5 d的幼果中果肉细胞变化，指出开花后3 d可能是其快速膨大的启动时期，授粉后5 d细胞明显增大且排列紧密。梁世才等[6]在对厚皮甜瓜的研究中指出，M01-3厚皮甜瓜自授粉至果实软化成熟的过程中经历了一个细胞迅速生长分裂到生长速度减慢的过程，果实成熟时外果皮细胞间填充大量的木质素成分，中果皮细胞高度分散，细胞相互融合。高美玲等[7]通过观察薄皮和厚皮西瓜外果皮的石蜡切片，总结出薄、厚皮西瓜外果皮细胞生长方向分别为纵向生长和横向生长，厚皮西瓜外果皮石细胞团较大且细胞较大。羊角脆甜瓜在薄皮甜瓜中外观颜色、形状及口感均独具特色，而其果皮发生的斑块及瘤状凸起严重影响经济品质，从而导致销量的降低，果实宏观表现与其微观结构密不可分，针对其果皮进行的显微观察意义重大，而目前未见对羊角脆薄皮甜瓜细胞形态及色素分布的研究报道。笔者对羊角脆甜瓜果实发育过程中果皮细胞形态和色素分布进行了显微观察，以期了解羊角脆甜瓜果皮发育过程、瘤状凸起及色斑成因，为改善果实外观品质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试材为青县蔬菜技术服务中心提供的地方品种青县羊角脆。

1.2 方法

试验时间为2019年1—7月，其中育苗、种植及取样部分在青县司马庄绿豪农业专业合作社日光温室内进行。切片制作及显微观察部分在河北农业大学园艺学院园艺植物栽培生理实验室进行。于2019年1月14日使用50孔穴盘育苗，2019年2月20日定植，总试验面积1000 m2，株距35 cm，行距90 cm，生长期间吊蔓栽培，单蔓整枝，在主蔓12～15节留果。4月7日对盛花果实进行授粉，授粉当天第1次取样，至5月7日（果实商品成熟）每5 d取样1次，共7次，每次取发育正常果实10个，切取样品近果脐1/3处外果皮及其以内的0.5 cm中果皮制作石蜡切片，观察自外果皮20层以内细胞的形态变化;商品成熟期取正常和果面瘤状凸起的果实各10个，分别取正常部位和凸起部位果皮制作石蜡切片，观察自外果皮以下30～60层细胞形态，测量细胞长轴及短轴的长度;取灰白色正常果实和分别带有黄色、绿色、黄绿色斑块的果实各10个，分别切对应部位的单层外果皮（表面）、外果皮及其以内0.5 cm中果皮（剖面），制作徒手切片，进行果皮色素分布显微观察。

徒手切片制作与观察：用双面刀片切取灰白色、黄色、绿色的果实外表皮，立即置于载玻片上，滴少许蒸馏水，压盖玻片，排净空气，使用OLYMPUS CX41RF生物显微镜观察。

石蜡切片制作与观察：在近果脐1/3处使用双面刀片横切果实，取外表皮及其以内的0.5 cm果皮，立即放入3.7%FAA固定液（V乙醇꞉V去离子水꞉V甲醛꞉V冰醋酸=10꞉7꞉2꞉1）中，真空泵抽真空20 min后置于梯度瓶中，60 r·min-1摇床上4 ℃固定过夜;依次使用50%、70%、85%、95%、100%乙醇脱水90 min，每个梯度加8滴2%曙红染色（1 g曙红粉末溶至50 mL乙醇），最后再次更换100%乙醇后不加染液4 ℃过夜;次日移至室温，于60 r·min-1摇床上使用V乙醇꞉V脱蜡剂（Histoclear）为0꞉1、1꞉1、1꞉0（3次）依次渗透1 h，最后更换100% Histoclear，样品上覆小块石蜡，V石蜡꞉VHistoclear约1꞉4;次日将梯度瓶置于42 ℃恒温箱，12 h后更换100%液态石蜡，置于60 ℃过夜;60 ℃环境下每隔24 h更换100%液态石蜡，连续更换4次，最后一次更换后5 h包埋，待蜡液完全凝固，置于4 ℃避光保存。使用组织切片刀将包含样品的蜡块切成梯状体固定于组织包埋盒，SLEE CUT 4062-手动旋转式石蜡切片机切7 μm薄片，37 ℃恒温水浴锅内摊片30 min，42 ℃烤片机烤片12 h，Histoclear脱蜡3次，每次10 min，OLYMPUS IX73倒置显微镜观察。

细胞截面长轴及短轴测量：取瘤状凸起果实和对照果实果皮纵切的石蜡切片各5片，拍照后在每片切片上随机选取10个细胞，使用ToupView软件测量其长轴和短轴长度。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段果实的果皮结构与细胞形态

由图1-A～G可以看出，羊角脆果实授粉当天和授粉后5、10、15、20、25、30 d（商品成熟）的果皮细胞形态。图1-A中果实最外层细胞为外果皮，外果皮以内为中果皮，中果皮又分为上中果皮和下中果皮，果实授粉当天外果皮细胞排列紧密，形状为矩形，细胞大小有差异，外果皮不平滑，上中果皮由4～6层等径圆形细胞组成，下中果皮细胞体积较大，同样为等径圆形细胞组成。授粉后5 d（图1-B）外果皮及中果皮细胞体积均有增大，细胞密度变小。至授粉后10 d（图1-C）细胞继续增大，外果皮细胞形状更加规则，由此外果皮变得平展光滑，上中果皮細胞继续增大，形状开始向椭圆形转变，下中果皮细胞排列紧密，形状变为椭圆形。至授粉后15 d（图1-D），外果皮细胞在垂直于表皮切线方向有明显增长，排列规则且紧密，中果皮细胞全部为椭圆形。至授粉30 d（图1-E～G），所观察的外果皮及中果皮细胞不再发生明显变化。另外，一部分羊角脆果实在发育中后期果皮会呈现瘤状凸起状态，造成果实表面凹凸不平，从而导致商品价值降低，图1-H为商品成熟的瘤状凸起果实果皮形态，在观察视野下凸起部位果皮的细胞形态、大小及细胞排列与正常果实无明显区别，而在若干层细胞下果皮细胞是否有差异还未可知。

2.2 瘤状凸起果皮细胞形态

图2为对照果实和瘤状凸起果实凸起部位外果皮以下30～60层细胞显微结构（取样部位为圆圈所示），对照果实（图2-A）细胞多为圆形至椭圆形，椭圆形细胞长轴方向多平行于表皮切线方向，其长轴长度均值为（71.90±14.16） μm，短轴长度均值为（41.93±8.97） μm。瘤状凸起果实凸起部位（图2-B）的细胞多数呈椭圆形，并且长轴方向多垂直于表皮切线方向，其长轴长度均值为（91.85±11.94） μm，极显著高于正常果实，短轴长度均值为（42.81±7.20） μm，与正常果实差异不显著，大量长轴垂直于表皮切线的细胞在局部积聚，导致果腔至外表皮距离增大，因此造成果皮瘤状凸起现象。

2.3 不同颜色果皮的色素分布

灰白色（GW）果皮及黄色（Y）、绿色（G）、黄绿色（YG）斑块果皮的色素分布情况见图3，果皮取样部位为圆圈所示。由图3可以看出，甜瓜果皮由外到内分别为外果皮细胞和若干层薄壁细胞，其中灰白色正常果实的外果皮不存在色素物质，在约10层以下的薄壁细胞内才有叶绿体（GW1～GW2）;黄斑果皮的外果皮细胞间隙存在黄色色素物质（Y1～Y2）;绿斑果皮在外表皮细胞下10层以内的薄壁细胞中含有叶绿体（G1～G2）;黄绿色斑块果皮的外表皮细胞间隙存在黄色物质，外表皮细胞下的10层薄壁细胞内存在叶绿体（YG1～YG2）。

3 讨论与结论

果实外观表现与果肉细胞形状、排列密不可分，有研究表明果皮厚度与果皮细胞层数和果皮射线方向细胞直径有直接关系[8-9]，微观结构的变化可能由于基因突变、授粉不良和生长环境所引起[10-12]。前人在对马家柚粗果皮的研究中指出，粗果皮形成主要是由于表皮油胞体积变大且有凸起导致，而粗皮果果皮增厚由于果皮射线方向细胞直径更大，细胞间隙大引起[13]。损伤对果皮结构影响大，在对脐橙的研究中指出，轻微机械损伤后果皮经一系列复杂过程最终导致脐橙油胞破裂，宏观表现为果实表面有许多小坑，严重影响其外观品质[14]。生产中发现羊角脆甜瓜时有发生瘤状凸起的问题，而当前针对该现象的研究未见报道，本试验表明引起羊角脆果皮瘤状凸起的原因主要是大量长轴垂直于表皮切线的细胞在局部积聚，导致果腔至外果皮的距离增大，从而引起瘤状凸起现象。本试验仅明确了瘤状凸起果实的细胞形状及排列，但该现象具体发生条件以及改善措施还需进一步研究。

果实颜色是评价外观品质的重要指标，而色素种类、分布及含量直接决定了果实颜色[15]。黎明等[16]指出在黄肉桃花后65 d，外果皮下第4～12层果肉细胞分布大量叶绿体，数量由外向内逐渐减少，随发育叶绿体数量下降、体积缩小，至果实成熟，叶绿体完全转化为有色体。对于樱桃番茄，在其果实绿熟期叶绿素含量极高，外观表现为通体绿色，经过转色期到成熟期果实叶绿素逐渐降低至较低水平，而胡萝卜素和番茄红素逐渐增加，到果实成熟番茄红素占据总色素含量的90%以上，此时果实表现通体红色[17]。Huang等[18]在对砂梨的研究中指出，果实遮光对果皮花青素含量有显著影响，完全暴露于阳光下2～3周的果实可合成大量花青素，这表明光照对花青素的合成至关重要。羊角脆甜瓜成熟果实果皮颜色独特，为通体灰白色，目前关于羊角脆甜瓜果实颜色的研究未见报道，本试验结果表明正常的羊角脆商品成熟果实中有色物质为叶绿素，并且叶绿素出现在约10层以下的薄壁细胞内，果实外观显现灰白色。另外，叶绿体出现在10层以内的薄壁细胞中使外果皮显现绿色斑块;外表皮细胞间隙出现黄色色素物质使外果皮显现黄色斑块;外表皮出现黄色色素物质的同时外表皮下10层薄壁细胞内出现叶绿体而使果皮显现黄绿色斑块。本试验初步阐明了羊角脆甜瓜的色素分布，但色素的发生条件以及控制颜色发生的技术措施还需进一步研究。

羊角脆甜瓜外果皮由单层矩形细胞组成，紧密排列在果实最外层，细胞长轴的走向垂直于表皮切线，中果皮细胞在发育过程中层数逐渐增多，形状由圆形变为椭圆形，细胞的长轴走向平行于表皮切线;果实自授粉0～15 d细胞增大迅速，15 d后至成熟细胞形状和排列不再发生明显改变;果实异常瘤状凸起是由于外表皮30层以下的细胞长轴增长，且部分椭圆形细胞长轴走向变为垂直于表皮切线造成;羊角脆正常成熟果实自外果皮10层以下的薄壁细胞存在叶绿素，而10层以内细胞无色素，果皮呈灰白色;果皮上的绿斑是因为外果皮10层以内细胞出现了叶绿素;黄斑则是因为外果皮细胞间出现了黄色色素物质;两种情况发生在同一区域时，果皮出现黄绿色斑块。

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