消瘀止血方对迁延期下肢深静脉血栓形成患者非活性菱形蛋白2/解离素金属酶17信号通路表达的影响

马陈 帅波 沈霖 卢芙蓉 杨艳萍 徐晓娟 廖奕

下肢深静脉血栓形成(Lower Extremity Deep Venous Thrombosis，LDVT)属于中医“股肿”“脉痹”等证，就其病机，乃血瘀滞塞脉道所致。笔者前期研究表明[1]，消瘀止血方治疗LDVT慢性期疗效较好，其机理之一与该方可明显降低患者血清肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)及解离素金属酶17(a Disintegrin and Metalloprotease，ADAM17)表达水平有关。近年来研究发现，非活性菱形蛋白2(Inactive Rhomboid-like Protein 2，iRhom2)是ADAM17关键的耦合子，并调控其释放促炎性细胞因子TNF-α的活性[2-3]。为此，本文检测了迁延期下肢深静脉血栓形成患者iRhom2/ADAM17蛋白的表达变化，旨在探讨iRhom2/ADAM17信号通路是否参与了下肢深静脉血栓形成病理过程及消瘀止血方治疗本病的疗效机理，现报告如下。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年10月至2019年5月本院中西医结合骨伤专科门诊确诊的迁延期下肢深静脉血栓形成患者67例作为治疗组，另选来本院体检中心经专科检查，下肢静脉及血小板聚集功能检测均无异常发现的体检者50人作为正常对照组。

1.2 诊断标准

按照中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会制定的下肢深静脉血栓形成诊断标准(2015年修订稿)[4]。

1.3 纳入标准

1)符合上述诊断标准；2)因胸腰椎骨折，下肢骨折后长期卧床者；3)旅行久坐交通工具者；4)原因不明的血小板聚集率升高者。所有纳入患者及其家属对本实验知情同意，并得到华中科技大学同济医学院伦理委员的批准。

1.4 排除标准

入选患者均排除急性动脉栓塞、急性淋巴管炎、丹毒、原发性盆腔肿瘤、小腿损伤性血肿、小腿纤维组织炎等疾病。

1.5 方法

1.5.1治疗方法 1)中药治疗 患者均给服消瘀止血方[1]治疗。本方由黄芪20 g，党参20 g，当归20 g，白芍药10 g，桃仁10 g，甘草6 g组成。由本院门诊中药房煎制，每天1剂，分2次服用。10 d为1个疗程，治疗6个疗程后，观察疗效。中药治疗期间停用其他溶栓、抗凝、祛聚和活血化瘀等功效的中、西药物。

2)弹力袜治疗 所有患者行走活动时均使用医用弹力袜(舒尔美SOUERMEI，北京康达人和科技有限公司，二类注册证号为国械注许 20162640418号)。

1.5.2疗效评定方法 参照中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会制定的下肢深静脉血栓形成疗效标准(2015年修订稿)[4]评定近期疗效。

疾病疗效判定标准：痊愈为临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥90%；显效为临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70%且<90%；有效为临床症状、体征均有好转，证候积分减少≥30%且<70%；无效为临床症状、体征无明显改善，甚至加重，证候积分减少不足30%。

单项症状疗效判定标准：临床痊愈为症状消失，积分降至0分；显效为症状明显改善，积分降低2个等级；有效为症状有所改善，积分降低1个等级；无效为症状无改善或加重，积分未减少或有所增加。

1.5.3观察方法 观察治疗前后症状、体征变化，彩色多普勒检查股静脉、腘静脉及小腿静脉丛再通情况。

1.5.4蛋白印迹法(Western Blot)检测iRhom2和ADAM17表达 主要抗体iRhom2(货号Ab116139)、ADAM17(货号Ab39162)、pro-ADAM17(货号Ab75181)均为Abcam公司产品；GAPDH(货号2118 )为CST公司产品；二抗(货号PAB150011)为 BIOSWAMP公司产品。真空采血管采集中、西药治疗前后患者及正常对照组的外周血后，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min。以1.2×104r/min离心15 min后，收集上清，使用Bradford法测定蛋白浓度，-80 ℃保存。上样前加入上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min。每个样本取30 μg蛋白上样，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白并转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉常温封闭30 min后，加入iRhom2，ADAM17和pro-ADAM17一抗，4 ℃孵育过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶连接的二抗，室温下孵育45 min。ECL-Plus显影曝光，用图像分析软件将其扫描并测定灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

纳入治疗组研究的患者共67例，其中男41例，女26例；年龄53～76岁，平均(62.70±11.59)岁；病程26～86 d，平均(44.87±29.23)d；左下肢31例，右下肢28例，双下肢8例。正常对照组共50例，男30例，女20例，平均年龄(58.38±13.51)岁。

2.2 临床疗效

治疗期间有7例患者违反方案，使用了迈之灵、三七皂甙、复方丹参片、丹红注射液等药物被剔除。实际参入临床疗效统计者共58例，其中治愈12例，显效31例，有效9例，无效6例，总有效率为89.7%。

2.3 治疗前后单项症状、体征疗效

消瘀止血方治疗后，患者疼痛、皮肤色泽、肿胀及浅静脉怒张均有明显改善，见表1。

表1 治疗前后单项症状、体征疗效(例)

2.4 治疗前后多普勒检测结果

消瘀止血方治疗后，腘静脉完全闭塞的再通率最高(82.7%)，其次为股静脉(66.7%)，再次为小腿静脉丛(54.5%)，见表2。

2.5 治疗前后iRhom2和ADAM17蛋白表达变化

迁延期下肢深静脉血栓形成患者iRhom2，ADAM17蛋白表达水平明显高于正常组，差异有统计学意义(P< 0.01)；pro-ADAM17与正常组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。消瘀止血方治疗60 d后，iRhom2及ADAM17蛋白表达明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义(P< 0.01)，见图1。

表2 治疗前后多普勒检测结果比较 (例)

图1Western Blot检测LDVT 患者iRhom2，ADAM17，pro-ADAM17蛋白表达结果

3 讨论

下肢深静脉血栓形成临床上分为急性期、迁延期和后遗症期[4]。急性期病程在72 h之内者可使用溶栓药物，甚至手术取栓治疗[5]。迁延期为发病后14 d～3个月[4]，临床上多采用卧床休息，抬高患肢，穿着长统弹力袜；长期使用抗凝药如华法林等；辅助使用祛聚药物，如阿司匹林、潘生丁等，稀释血液、降低血液黏稠度，防止血小板凝集；对于疼痛肿胀和静脉炎者，使用迈之灵或非甾体消炎止痛药物，如吲哚美辛、双氯芬酸钠、吡罗昔康等。甚至消极等待血管再通，静脉瓣膜破坏后再进行瓣膜成形、瓣膜移植等治疗，往往错过最佳治疗时机从而导致患者后遗症期症状较重[6]。本研究纳入病例多数已在本院骨外科及血管外科住院或门诊治疗期间，经过系统溶栓、抗凝、祛聚等综合疗法；全部患者均先后使用过华法林、迈之灵、阿司匹林、血栓通、丹红注射液及川芎嗪注射液等药物，迁延未愈而要求用中药煎剂治疗。

近年来中医药治疗在改善迁延期下肢深静脉血栓患者临床症状、降低并发症方面取得了显著的疗效[7]。中医认为迁延期下肢深静脉血栓形成的病机为气虚血瘀，此期热邪渐去，气虚运血无力，血行缓慢导致血瘀。气血运行不畅，瘀血阻络经脉，日久则致股肿。治宜益气活血，消瘀止血。本课题组拟定的消瘀止血汤由黄芪、党参、当归、白芍、桃仁、甘草6味中药组成，其中黄芪、党参健脾益气生血，当归、白芍养血活血，桃仁化瘀通脉，甘草调和诸药，诸药合用具有益气生血、化瘀通脉之功效。本研究结果显示用该方治疗本病，在患肢肿胀、疼痛、皮肤色泽及浅静脉怒张的症状或体征，恢复病变静脉再通率等方面均有明显改善。

ADAM17又称TNF-α转化酶(Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme，TACE)，主要作用之一就是TNF-α的加工与释放[8]。ADAM17的上游分子伴侣iRhom2能够特异性地调节ADAM17转运、活化及胞外段蛋白水解功能[2-3]。iRhom2首先在内质网与ADAM17前体蛋白(pro-ADAM17)直接结合，一起转运至高尔基体，pro-ADAM17水解掉一段N端结构域，转化为成熟pro-ADAM17，最后定位于细胞膜[9]。ADAM17可将在巨噬细胞、淋巴细胞和单核细胞中合成的TNF前体(pro-TNF)的胞外段水解，切割成分泌型的全身性炎症因子TNF-α，是多种疾病的病理性损害[8]因素之一，包括下肢深静脉血栓形成[1]。

为此，在前期研究[1]显示下肢深静脉血栓形成慢性期患者血清ADAM17和TNF-α高表达基础上，采用蛋白印迹法观察其上游促炎信号通路iRhom2/ADAM17在迁延期下肢深静脉血栓形成患者中的表达，并与正常体检者进行对照。结果显示迁延期下肢深静脉血栓形成患者iRhom2及TACE蛋白表达水平均明显高于正常人群，表明iRhom2/ADAM17信号通路异常表达参与了下肢深静脉血栓形成的病理过程。本实验迁延期下肢深静脉血栓形成患者和正常体检者pro-ADAM17差异无统计学意义，进一步提示迁延期下肢深静脉血栓形成患肢肿胀、疼痛发生或加重的机理之一，是iRhom2通过与无活性的ADAM17前体蛋白结合后，激活iRhom2/ADAM17信号通路，释放TNF-α，导致患肢炎性肿痛和深静脉炎。

此外，有研究表明[10]ADAM17还可介导血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ib-Ⅳ-Ⅴ及其亚基GP Ⅰbα的水解活性。GPIb-Ⅳ-Ⅴ作为凝血酶和血管性血友病因子( von Willebrand Factor，VWF) 和共同受体一旦水解，可释放出可溶性GP Ⅴ片段，使血小板在高速血流条件下，以滚动方式黏附与损伤血管内皮，诱发血栓形成[11-12]。

本研究结果显示消瘀止血方治疗后患者iRhom2/ADAM17蛋白表达水平明显下降，这一方面有利于改善患肢炎性水肿对深静脉的压迫和静脉炎，有利于病变血管内皮及瓣膜的修复；另一方面，可降低患者异常的血小板活化和黏附，减少新的小血栓形成。这在一定程度上可以解释尽管本方没有溶栓功能，但有促进迁延期下肢深静脉血栓的再通作用。

值得指出的是本研究未设置对照组，究其原因为下肢深静脉血栓形成有并发肺栓塞风险，如诊疗不及时会遗留血栓形成后综合征(post-Thrombotic Syndrome，PTS)，发生小腿皮肤溃疡等。从伦理角度，本研究不宜设阳性药物对照组。由于本研究纳入的全部患者均先后使用了祛聚药物，迁延未愈而转诊要求用中药煎剂治疗，从患者依从性角度，设置阳性药物对照组在本研究中亦无临床可行性。