NEK2低表达与胃癌进展及不良预后密切相关

葛 晨，朱征海，张晓鑫，程 杰，周 英，许紫鹏，张银超*

（1.无锡市锡山人民医院普外科，江苏 无锡 214000；2.无锡市人民医院普外科，江苏 无锡 214000）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，我国是胃癌高发的国家[1-2]。胃癌早期往往无症状或仅有轻微症状，容易被忽视，当临床症状典型时，多已属中晚期，错过了最佳的治疗机会。尽管近年来，手术方式、放化疗、靶向治疗以免疫治疗等治疗方式得到飞速发展，胃癌患者5年生存率仍只有40%[3]。 因此，寻找早期诊断的生物标志物、预后判断指标以及药物治疗的有效靶点尤为重要。

中心体相关蛋白激酶2（NIMA-related expressed kinase 2, NEK2）是NEKs家族的一员，是一种丝氨酸-色氨酸激酶，与细胞周期G2/M期的中心体分裂密切相关[4-5]。研究表明，NEK2不仅能通过调节中心体间接调控细胞分裂，还能通过作用于染色质直接参与细胞分裂[6- 7]。NEK2的异常表达导致中心体分离障碍，中心体异常和非整倍体的出现，使细胞恶化，最终导致肿瘤发生[8]。而且，NEK2过表达能激活多个肿瘤相关信号通路和ATP结合盒转运蛋白，从而促进肿瘤增殖、侵袭和耐药[9]。已有研究发现NEK2在多种肿瘤中异常表达，如：乳腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌等。NEK2异常表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及患者不良预后密切相关。目前NEK2在胃癌组织中的表达情况鲜有报道。

本研究旨在通过免疫组化方法明确NEK2在胃癌组织中的表达情况，探讨NEK2表达与临床病理特征以及预后的关系。本研究的开展为NEK2基因功能及胃癌研究提供思路。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集无锡市锡山人民医院2006年至2009年间76例胃癌患者的癌及癌旁组织，并且具有完备的病理资料和随访信息。所有标本均经病理诊断为胃癌，同时患者术前未接受任何放化疗，术后根据诊疗规范进行化疗。样本收集前均通过无锡市锡山人民医院伦理委员会批准及患者知情同意。术后每三个月随访一次，随访时间为0-101月，对在本院治疗和复查的病人进行详细登记，其余病人进行电话随访。

1.2 主要试剂

Envision免疫组织化学检测试剂盒购自上海今迈生物科技有限公司，NEK2兔抗人单克隆抗体购自上海信裕科技有限公司，DAB酶底物显色试剂盒购自福建迈新有限公司，磷酸盐缓冲液（PBS） 、牛血清白蛋白（BSA）、3 %H202溶液 等购自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫组化检测

常规石蜡切片二甲苯脱蜡， 梯度浓度酒精脱水。用3%H2O2200ml浸泡10min，抗原修复液修复2次，滴加5% BSA封闭液，室温放置35min。滴加适量的NEK2一抗，4℃过夜。用PBS洗4次，滴加二抗，37℃下放置35min，用PBS洗涤4次。根据试剂盒说明，配制显色液。显色完后水洗，滴加苏木素染液，浸染2min，然后水洗，无水乙醇脱水，二甲苯中透明。

1.4 结果判读

免疫组化的结果根据染色强度和表达比例来综合判定。本研究由两位专业的病理医师来判读，当出现结果不一致时经商议决定。表达强度：每张切片上观察5个高倍视野（×400），无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。积分综合计量：每种阳性强度对应的值×该强度细胞的百分比，即1×弱阳性百分比+2×中等阳性百分比+3×强阳性百分比。按照积分综合计量中位值分为高表达组和低表达组。

1.5 数据下载

登录GEO数据库网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），在GEO数据集中搜索并下载GSE84437的芯片数据及对应的临床样本信息。根据患者的样本编号、随访时间及生存状态是否完成，共获得434位胃癌患者的数据。

1.6 统计分析

应用SPSS 23.0统计软件处理分析数据。配对差值非参数检验（Wilcoxon符号秩和检验）比较胃癌组织和癌旁组织中NEK2蛋白的表达差异；用四格表卡方检验以及Fisher精确检验分析NEK2蛋白表达与临床指标的关系；用Kaplan-Meier法和Logrank检验分析各变量与预后的关系，应用多因素COX比例风险模型评估对生存影响的独立因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NEK2蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达

在胃癌及癌旁组织中，NEK2蛋白主要在细胞质中表达，呈棕黄色（图1）。通过秩和检验发现，NEK2蛋白在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织（Z=-4.333，P=0.000，图2）。根据积分综合计量中位值，胃癌组织中NEK2蛋白高表达组37例，低表达组39例（表1）。

表1 NEK2表达与胃癌患者临床病理特征的关系

2.2 NEK2表达与胃癌临床病理特征的关系

从表1我们看出，NEK2的表达与性别、年龄，浸润深度、淋巴结转移、M分期、TNM分期、肿瘤直径以及肿瘤位置无关（表1）。有趣的是，我们通过亚组分析发现，在非胃窦部胃癌中，NEK2低表达与淋巴结转移（P=0.041）、TNM分期（P=0.004）呈负相关，但是与性别、年龄，浸润深度、远处转移、肿瘤直径无相关性（表2）。

2.3 NEK2表达与胃癌患者预后的关系

我们采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并采用Logrank检验分析来研究NEK2表达与胃癌患者预后的关系。NEK2低表达组总生存率明显低于NEK2高表达，且结果具有统计学差异（P=0.022，图3）。为了进一步验证NEK2表达在胃癌患者预后的影响，我们从GEO数据库下载GSE84437数据，并采用Kaplan-Meier及Log-rank检验进行，再次证实NEK2低表达组较NEK2高表达组的总生存率低（P=0.027，图 4）。而且我们对影响肿瘤预后的因素进行COX多因素分析，结果显示肿瘤直径（P=0.033）以及N E K 2 表达（P=0.0 4 6）是胃癌预后的独立影响因素（表3）。

表2 NEK2表达与非胃窦部胃癌患者临床病理特征的关系

表3 单因素与多因素Cox风险回归分析对胃癌患者总体生存独立因子的检验

3 讨 论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。目前针对胃癌早期诊断、预后判断及靶向治疗方面开展了大量的研究，但临床转化的标志物少之又少，因此，亟需进一步研究。本研究系统地分析了NEK2在76例胃癌患者组织中的表达情况，探讨了NEK2的表达与临床病理特征以及预后的关系。已有研究表明，NEK2在多种肿瘤中呈高表达，而且NEK2高表达提示不良预后。但是，在我们的研究中发现，NEK2在胃癌组织较癌旁组织中低表达（P=0.000）。同时，在非胃窦部胃癌中，NEK2的表达与淋巴结转移（P=0.041）、TNM分期（P=0.004）呈负相关。此外，Kaplan-Meier法分析结果显示，NEK2低表达预示不良预后（P=0.022），而且这一结果在GSE84437（P=0.027）中得到进一步证实。COX多因素分析结果提示，肿瘤直径（P=0.033）以及NEK2表达（P=0.046）是预后良好的独立影响因素。

NEK2是细胞周期G2期的关键蛋白，调控染色质的分离。细胞周期紊乱是肿瘤细胞的特征之一，异常的细胞周期促进肿瘤的增殖[10- 11]。异常表达的NKE2可引起中心体不稳定及非整倍体的出现，诱发细胞癌变。研究表明，NEK2通过MAPK信号通路调控肝癌细胞增殖、凋亡[12]。NEK2过表达促进乳腺癌细胞增殖，下调NEK2表达影响中心体分裂过程，导致非整倍体的出现，同时增加半胱天冬酶3切割，增加抑癌蛋白Rb的活性，降低组蛋白H3的活性，抑制肿瘤生长[13]。抗细胞凋亡是NEK2介导的细胞周期紊乱带来的另一个的结果。在骨髓瘤体内和体外模型中发现，NEK2抑制导致切割的腺苷二磷酸核糖聚合酶表达增高，同时活化半胱天冬酶3/8/9[14]。这些结果提示NEK2有可能通过影响细胞周期来调控胃癌的发生、发展。

NEK2的表达与肿瘤转移以及耐药亦密切相关。NEK2过表达能上调β调连接蛋白的表达以及核内蓄积，激活β活连接蛋白信号通路，促进肺癌、多发性骨髓瘤的转移。NEK2活化苏氨酸激酶/核转录因子及基质金属蛋白酶促进肿瘤转移，活化的IL-8协同氨酸激酶/核转录因子通路促进血管生成，同时上调ATP结合盒转运家族蛋白10表达，增强肿瘤耐药[15]。我们的研究发现在非胃窦部胃癌中，NEK2的表达与淋巴转移呈负相关。这一结果提示我们，NEK2可能通过影响胃癌转移相关通路发挥作用。

综上所述，NEK2在胃癌组织中低表达，在非胃窦部胃癌中与淋巴结转移、TNM分期呈负相关。NEK2低表达与胃癌患者不良预后显著相关，且是独立的影响因素，有可能成为胃癌预后判断指标之一。而进一步研究NEK2在胃癌发生、发展中的机制，将为NKE2作为临床靶向药物开发的潜在靶点提供思路和理论基础。

图1 免疫组化检测NEK2在胃癌和癌旁组织中的表达（×200）。A、C为癌旁组织，B、D为癌组织，A、B为NEK2低表达，C，D为NEK2高表达

图2 NEK2在胃癌和癌旁组织中表达积分的秩次评分

图3 NEK2表达与胃癌患者总生存的关系

图4 GSE84437中NEK2表达与胃癌患者总生存的关系