分析孕妇血浆游离胎儿DNA检测在无创产前诊断中的应用价值

杨元伍，钟文富

（广西贵港市人民医院，广西 贵港 537100）

随着国内医疗技术条件的提高和对遗传性疾病认识的加深，孕妇对产前检查的重视程度越来越高。以往国内主要是通过羊水穿刺、绒毛膜活检或脐静脉穿刺术等方法进行产前检查，由于检查方法都有一定的创伤性，给孕妇和胎儿都带来了感染、出血等风险，严重者甚至流产。而进行血清标记物或超声波检测虽无创，但灵敏度较低[1]。如何通过无创检查对胎儿进行产前基因诊断一直是临床医务工作者努力攻破的课题。自国外第一次证实孕妇血浆中存在胎儿的游离DNA开始，一种新的无创性产前检测方法诞生了。为进一步验证孕妇血浆游离胎儿DNA检测在无创产前诊断中的应用价值，本次研究应用高通量基因测序技术检测220例孕妇血浆游离胎儿DNA的产前诊断结果，分析胎儿染色体的情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为2018年12月-2019年12月在贵港市人民医院进行产前诊断的220例孕妇，所有孕妇均为孕周14周以上（含14周），所有孕妇均自愿选择高通量基因测序进行唐氏筛查，并签署知情同意书。孕妇的年龄最小为22岁，最大为42岁，平均年龄（27.4±5.3）岁；其中首次怀孕的有180例，再次或多次怀孕的有40例，排除存在严重贫血的孕妇。

1.2 检测方法

①血浆分离：抽取孕妇外周血5 ml，采用EDTA抗凝并于4℃暂存。要求要在2 h以内完成该步骤操作。1600 r/min离心10 min后，吸取上层血浆；然后16000 r/min离心10 min，吸取血浆送检。②采用美国Qiagen公司生产的产品高盐吸附低盐洗脱方法来将每份血浆过柱提取游离DNA。然后将获得的有力DNA经过末端补平、加“A”、加接头、PCR富集，最终获得对应样本的DNA文库。③将获得的DNA文库经过nglent2100检测和Q．PCR定量后，按规格进行文库Pooling，然后经C-bot桥式反应扩增，最后送HiSeq上机测序，获得原始数据直接传送到大型机。④每一测序reads染色体定位通过比对到Ensemble数据库的人类基因组参考序列来确定。然后计算每一母体血浆样本中21、18、13号染色体序列数目比率。Y染色体来源的reads比率也通过同样的方法计算获得并且用于估计该男胎孕妇血浆中胎儿DNA浓度。通过测试样本的21、18、13号染色体reads比率减去对照组（怀有正常胎儿孕妇）的21、18、13号染色体reads比率的均值后再除以对照组内21、18、13号染色体reads比率的标准差，最终得出测试样本21、18、13号染色体的标准化z值。若z值≥3，即认为待测样本为三体高危；若z值≤-3，则为单体高危[2]。

羊膜腔穿刺及脐血穿刺术按照常规方法进行，然后采用VideoTesT—Kary03.1（美国）全自动染色体分析系统进行胎儿染色体核型分析。

2 结 果

2.1 DNA检测（高通量基因测序）结果

220例孕妇中共检出11例染色体高风险胎儿，其中1例为X单体，5例2l-三体、3例18-三体和1例13-三体，1例可疑高风险胎儿，敏感度为100%（10/10），特异度为99.5%（209/210）。

2.2 羊水/脐血细胞核型分析结果

经过检查证实有1 0 例为染色体异常，分别为6 例2l-三体、3例18-三体和1例13-三体，详见表1。

表1 DNA检测与产前诊断结果对比

3 讨 论

有专家认为，从免疫学角度，肿瘤和机体的关系类似于胚胎和母体之间的关系，既然从肿瘤患者血浆中分离出的DNA可以作为肿瘤诊断的指标，那么从胚胎母体分离出的DNA可能有部分来自于胎儿，自从孕妇母体血浆和血清中检侧胎儿来源的游离DNA后，产前诊断的无创化成为研究者们关心的热点。与传统的产前诊断技术比较，无创产前诊断技术对胎儿没有任何风险，只需要抽取孕妇5 ml的血浆就可以进行检测[3]。相关的研究显示，DNA检测技术对于检测2l-三体、18-三体以及13-三体的敏感度和特异度都非常高，本次研究的结果与这些研究的结果是类似的，敏感度达到100%，特异度为99.5%，说明了孕妇血浆游离胎儿DNA检测对于分析胎儿染色体的异常情况在临床上是可行的，与传统的方法比较，该技术的准确性高，且没有创伤，减少了不良事件的发生。

由于高通量基因测序的准确率较常规的血清学唐氏筛查，即检测孕妇血清标志物甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇（uE3）、绒毛膜促性腺激素（B—HCG）三联筛查的准确率高，临床上对该法的接受度也逐步提高。有些孕妇甚至直接选择基因测序技术来代替血清学唐氏筛查，忽视了该法除非整倍体疾病外的微缺失、易位、微重复或其他染色体异常不能检出的缺点。而筛查高风险不仅仅对Ds有筛查异常，经产前唐氏筛查21-三体高风险而行产前诊断的病例中有约30%为性染色体或其他染色体异常，这一结论提示高通量基因测序技术存在一定的片面性，不能完全取代血清学唐氏筛查技术。

此外，在本次研究中检测中1例X单体的孕妇，最终经过羊水细胞培养证实为46.XX的正常核型。相关的研究中也提示，“Y染色体偏多”和“X染色体偏

少”的孕妇。经羊水细胞染色体核型分析分别为“47，XYY”和“45,x”。这样的结果说明目前DNA检测在分析性染色体上的准确率还比较低，是需要进行羊水细胞培养才能够进行确诊，而且该方法除整倍体疾病外的微缺失、易位、微重复或其他染色体异常该法也不能检出，加上目前的检测费用还比较高，在临床上的推广还需要有待改进。

综上所述，孕妇血浆游离胎儿DNA检测可用于筛查胎儿染色体拷贝数异常的检测，其灵敏度和特异度高，在检测过程中无创伤，减少不良事件的发生，值得临床推广使用。