CD209基因3′非翻译区多态性与川崎病的关联性研究

冯建英，杨 勇，严晓华，闫鲜鹏，卫 丽，高 娜，贺 望，万 萱，郑千千，焦富勇

(陕西省人民医院儿童病院，陕西 西安 710068)

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种以全身血管炎性病变为主要病理表现的急性发热出疹性小儿疾病，冠状动脉损伤(coronary artery lesions，CAL)是其主要并发症，已经成为儿童获得性心脏病的最常见病因，其发病原因尚不清楚。大量临床及流行病学研究资料显示KD的发生与遗传易感性密切相关[1-2]；有研究发现PEAR1、MPO、FCGR2A及BLK等众多免疫相关因子基因均为KD的重要遗传易感基因[3-6]。树突状细胞特异性C凝集素(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing non integrin，DC-SIGN)是具有糖结合域的Ⅱ型跨膜蛋白，人DC-SIGN由CD209基因编码，是树突状细胞表面重要的粘附分子受体，能够介导树突状细胞与初始T细胞聚集，识别和介导多种病原体在人体内特异性免疫反应的发生，在机体区域免疫和适应性免疫反应中发挥重要功能[7-8]。有证据表明CD209基因启动子多态性与KD的易感性密切相关[9]。CD209基因高度多态性的特征及存在众多的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)[10]，故为了进一步研究CD209基因是否存在其它导致KD发病的候选SNP，本课题以中国陕西西安地区汉族儿童为研究对象，采用Long-PCR方法对CD209基因进行全长测序，以分析CD209基因3′非翻译区(3′untranslated，3′UTR)位点的多态性与儿童KD的遗传易感性和CAL的关联性。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年9月至2019年9月在陕西省人民医院儿童病院住院的KD患儿40例(KD组)，其中男25例，女15例，年龄为8个月至8岁，平均(3.39±1.77)岁。所有病例均符合KD国际诊断标准[11]，所有患儿均在治疗中进行超声心动图检测，根据是否合并CAL[11]，将KD组分为CAL组(男9例，女5例)和非CAL(NCAL)组(男15例，女11例)。CAL的纳入标准：①<5岁者，内径绝对值≥3mm；②≥5岁者，内径绝对值≥4mm；③某段管径为邻近段的1.5倍及以上；④管壁明显不规则。KD的排除标准：①合并其它自身免疫性疾病或者获得性免疫缺陷病的患儿；②合并肿瘤的患儿；③合并先天性疾病的患儿；④有遗传、代谢性疾病儿童；⑤合并脑瘫、中枢协调障碍者。收集同期在陕西省人民医院儿童病院健康体检儿童40例纳入对照组，其中男性20例，女性20例，年龄为10个月至8岁，平均(3.41±1.92)岁，既往均无KD病史，排除标准与KD组相同。两组均为无血缘关系的陕西西安地区汉族人群，且在性别、年龄方面分布均无显著性差异(均P>0.05)。所有研究对象入组均得到家长同意，并签署知情同意书。研究项目得到陕西省人民医院伦理委员会批准。

1.2血液标本的收集

所有患儿在入院当天抽取静脉血2mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.3实验方法

1.3.1 DNA的提取及PCR扩增

使用迈基诺基因组DNA提取试剂盒对待测样本进行核酸提取，提取后的DNA使用Nanodrop 2000进行质检。根据美国加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz，UCSC)数据库中人类基因组数据库CD209基因(NM_021155)的参考基因序列(chr19:7804881-7812464)，获取从该基因的5′UTR上游的1 000bp，到3′UTR下游的1 000bp的序列，设计两条引物序列，上游引物：5′-GGAGCCATGCCT GGTAGTTAT-3′，下游引物：5′-AATTCTTGAAAGATCCGGCCC-3′。使用Long-PCR方法，对CD209基因进行长片段扩增，获得CD209基因片段，扩增长度为8 396bp，并使用琼脂糖凝胶电泳法对所得片段进行质检。

PCR扩增总反应体系为50μL：包含5xPrime STAR GXL Buffer(Takara公司)10μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，gDNA(2.5ng/μL)2.5μL，2.5mmol/L dNTP Mixture(GENERAY BIOTECH公司)4μL，ddH2O为27.5μL，2.5μL模板和上下游引物(引物浓度均为4μmol/L)各2.5μL。两步法PCR反应条件：98℃ 10s 1个循环；98℃ 10s，68℃ 9min共30个循环；最后置于4℃保存。

1.3.2 PCR产物测序及分析

PCR产物经纯化后，合格样本使用Gen Cap®二代测序快速DNA建库试剂盒完成文库的构建。所得文库经Nanodrop 2000和琼脂糖凝胶电泳质检，并使用Illumina Nextseq 500测序仪进行上机测序。对测序完成的数据，使用GATK 4.0软件对数据进行预处理和拆分，并使用GATK的Haplotype Caller工具检测SNP及插入缺失多态性位点(insertion and deletion，INDEL)。最后，数据经Annovar(2018Apr16)软件和迈基诺自编脚本对SNP和INDEL结果进行注释，关联到多个数据库，得到数据分型和数据信息。

1.4 CD209基因3′UTR区TagSNP的选取

本研究采用连锁不平衡法进行TagSNP的筛选。利用美国国立生物技术信息中心网站(NCBI)SNP数据库下载中国南方汉族人群(CHS)和中国北京汉族人群(CHB)CD209基因的信息数据(GRCh37版本)，再利用Haploview 4.2软件选取TagSNP位点。在入选标准是连锁不平衡参数D’=1，连锁不平衡系数r2≥0.8，且最小等位基因频率(minimum allele frequency，MAF)≥0.1的条件下，选取CD209基因3′UTR区的TagSNP位点，最终目标区域共有5个TagSNPs位点入选。各位点信息见表1。

表1 CD209基因各位点信息

1.5统计学方法

2结果

2.1 PCR扩增结果

按PCR反应体系及条件，使用Long-PCR方法，对CD209基因进行长片段扩增，扩增产物目标片段长度为8 396bp，扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测，以15 000DNA marker(Trans Gen Biotech)作为对照，PCR产物条带位于7 000～10 000bp之间，提示PCR扩增产物为CD209基因，条带荧光亮度较强，且附近无其他条带，符合实验要求，表明其浓度与纯度可达直接测序的要求，见图1。

2.2 PCR产物测序结果

测序结果表明，引物可覆盖CD209基因全部区域，且覆盖度可达到100%，所有研究对象的基因组DNA中均检测到CD209基因5个目标TagSNPs位点，可以满足测试要求。部分KD患儿样本rs4804800G/A位点(chr19-7805128)分型测序图见图2、图3、图4。

注：M为15 000 DNA Marker，1和2分别代表2个待测CD209基因DNA样本。

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验

在所检验的对照组样本中，CD209基因5个TagSNPs的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)，具有群体代表性，如表2。

表2 对照组Hardy-Weinberg平衡检验结果

图2 19C069334标本rs4804800G/A位点测序图(GG基因型)

图3 17C056843标本rs4804800G/A位点测序图(AA基因型)

图4 19C048007标本rs4804800G/A位点测序图(GA基因型)

2.4 CD209基因多态性与儿童KD及CAL的关联分析

2.4.1各TagSNPs等位基因与儿童KD易感性的关联分析

KD组CD209基因rs4804800位点G等位基因分布频率显著高于对照组(χ2=3.906、OR=2.323，均P<0.05)，该位点携带G等位基因的患儿发生KD的风险显著增加，提示rs4804800位点G等位基因可能为儿童KD的风险等位基因；KD组CD209基因rs11465421位点T等位基因分布频率显著高于对照组(χ2=4.103、OR=2.333，均P<0.05)，携带T等位基因儿童发生KD的风险比携带G等位基因者增加2.333倍，提示rs11465421位点T等位基因可能为KD的风险等位基因。KD组其余位点等位基因频率与对照组间分布均无显著性差异(均P>0.05)。

2.4.2各TagSNPs基因型与儿童KD易感性的关联分析

KD组CD209基因rs4804800位点基因型分布频率与对照组间有显著性差异(χ2=4.528、OR=2.818，均P<0.05)，该位点携带G等位基因的基因型(G/A-G/G)较AA基因型发生KD的风险显著增加，考虑该位点携带G等位基因的基因型可能为儿童KD的风险基因型；KD组CD209基因rs11465421位点基因型分布频率与对照组间同样有显著性差异(χ2=4.381、OR=2.714，均P<0.05)，该位点携带T等位基因的基因型(G/T-T/T)较GG基因型发生KD的风险增加2.714倍，为儿童KD发病的风险基因型，提示rs4804800与rs11465421位点多态性与儿童KD的易感性关联。KD组其余位点基因型频率与对照组间分布均无显著性差异(均P>0.05)。

2.4.3各TagSNPs与儿童KD并发CAL易感性的关联分析

CAL组与NCAL组间各位点等位基因及基因型频率分布均无显著性差异(均P>0.05)，提示CD209基因各位点多态性与儿童KD并发CAL无关联。

CD209基因的5个TagSNPs等位基因及基因型分布频率在KD组与对照组及CAL组与NCAL组之间对比结果见表3。

表3 CD209基因各标签位点多态性与儿童KD及并发CAL易感性的关联分析(n)

3讨论

3.1 CD209基因多态性在炎性疾病免疫调节中的作用

DC-SIGN是一种具有多种免疫调节功能的树突状细胞跨膜凝集素受体，除了具有细胞粘附和识别病原体的功能外，还可以诱导信号传导途径，尤其是在与Toll样受体诱导的信号传导途径共激活时发挥作用，具有广泛的免疫调节功能[12-13]。人DC-SIGN由CD209基因编码，位于染色体19p13.2～13.3区，目前对CD209基因多态性与疾病的研究多集中于启动子区rs4804803位点上。Chaaithanya等[14]研究提示CD209基因启动子rs4804803 GG基因型与基孔肯雅热的易感性及感染患者的病情发展相关。Ren等[15]研究认为，CD209基因启动子rs4804803位点G等位基因与登革热感染患者的易感性及严重度密切相关。Chan等[16]研究发现，CD209基因启动子区rs4804803位点多态性与CD209基因分子的表达水平相关联，CD209基因rs4804803G启动子具有较低的有效结合位点和启动子活性，导致rs4804803位点携带G等位基因的中国SARS患者CD209基因蛋白表达下降，感染过程中免疫反应降低，肺损伤减少，同时反映SARS感染严重程度及预后的独立指标乳酸脱氢酶水平的升高风险显著降低。可见，CD209基因多态性在感染及炎症性疾病的免疫调节中发挥着重要作用。

3.2 CD209基因多态性与KD的关联性

CD209基因多态性与KD的易感性密切关联。Yu等[9]的一项病例对照研究发现，中国台湾地区人群CD209基因启动子区rs4804803位点的多态性与KD的发生密切相关，该位点的G等位基因是KD发生的危险等位基因，但与丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)耐药及CAL的形成无关。Kuo等[17]的研究显示，CD209基因的3′UTR区rs4804800位点的多态性与中国台湾地区人群KD风险间也存在显著相关性，但未发现该基因多态性与CAL形成及IVIG治疗反应有任何关联。由于CD209基因具有高度多态性的特征并存在众多的SNP，因此，有必要进一步研究CD209基因是否存在其它致KD发病的候选SNP。本研究对CD209基因3′UTR区的5个TagSNP进行关联分析后发现，陕西人群CD209基因3′UTR区rs4804800和rs11465421位点的多态性与KD儿童的易感性显著关联，但同样未发现该基因的遗传变异与KD患儿CAL形成相关联，与上述研究结果一致。CD209基因在3′UTR有多个多态位点，目前认为3′UTR区域为miRNA的靶向结合区，与mRNA的稳定性和蛋白表达相关，该区域发生的变异可能会影响miRNA调控作用及靶基因的表达[18]，故而推测该区域位点多态性可能会影响CD209基因分子的表达及MAPK通路的活性，进而参与了儿童KD形成的病理改变过程。在目前对SNP的研究中，由于缺乏相关基因位点的功能性研究，CD209基因的3′UTR区的作用尚不明确，但在KD中CD209基因的异常表达可能会影响疾病的进展及预后。虽然本研究中CD209基因3′UTR多态性与KD患儿CAL的风险缺乏联系，但是这些数据亦不能排除CD209基因在KD进展中的病理生理学作用。

综上所述，本课题结果显示，CD209基因多态性与陕西西安地区儿童KD的易感性有关，但与CAL的发生无关。CD209基因多态性在炎症信号传导和KD发展中的作用尚不清楚，需要进一步进行功能性研究来验证这些发现。本研究的样本量相对较小，可能会导致一些微效基因出现统计学上的遗漏，还需要后续进行更大样本的研究验证。