光肩星天牛对糖槭挥发物的EAG及嗅觉行为反应

马晓乾，葛 君，王 琪，赵红盈，孙 妍，高 宇，申国涛，于文喜

(1.黑龙江省林业科学院森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；2.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)，是一种危害多种阔叶树的蛀干性害虫，国内外广泛分布，主要以幼虫在树干内蛀食坑道阻断输送养分和水分而导致树木衰弱和死亡[1-3]。据报道，已有18属的树木受到光肩星天牛危害，由于其危害具有隐蔽性强、防治难等特点，给世界林业造成巨大的经济损失[3-6]。糖槭(Acersaccharum)又名羽叶槭，原产于加拿大，是我国北方城市的主要绿化树种之一，光肩星天牛对其危害非常严重[7-8]。

从昆虫和寄主植物间的化学通讯出发，利用寄主植物和非寄主植物挥发物研制引诱剂或驱避剂调控昆虫的嗅觉行为，配置非寄主植物也是控制害虫的一种途径，成为森林保护领域研究的热点和重点[9-13]。近年来，已有研究者探讨了光肩星天牛对寄主植物挥发物的触角电位(EAG)及行为反应，发现光肩星天牛感虫树种会释放较多的酯和萜类物质，而抗虫树种则释放较多的醇和醛类物质，S-α-蒎烯、S-β-蒎烯、乙酸己酯、R-α-蒎烯、水芹烯、莰烯等对光肩星天牛有明显的引诱作用，而罗勒烯、月桂烯、(E)-1-戊烯-3-醇、反-2-己烯醇、trans-香叶基丙酮等对光肩星天牛具有驱避作用[6,14-19]。而有关糖槭挥发物影响光肩星天牛寄主选择方面的研究未见报道。利用触角电生理及嗅觉行为测定是目前常用且比较成熟的确定植物挥发物对植食性昆虫寄主选择影响的有效途径[20-23]。为此，本研究利用顶空吸附法通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)、触角电位(EAG)及嗅觉行为测定技术，分析鉴定糖槭挥发物组分，解析糖槭挥发物对光肩星天牛入侵糖槭过程中产生的触角电生理及趋性行为影响作用，为光肩星天牛监测预警及通过引诱剂干扰等防控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物和昆虫

试验所用光肩星天牛雌、雄成虫和糖槭样树均采自哈尔滨市南岗区中山路行道绿化带，该绿化带主要栽植有10～20年生糖槭，树高6～10 m，胸径9～25 cm，研究期间光肩星天牛危害严重。将采集的每头光肩星天牛单独置于养虫瓶中饥饿24 h，待用。

1.1.2 植物挥发物及其配制

糖槭挥发物组分根据研究中GC-MS实验分析结果，选取购自阿拉丁公司生产的且含量排在前12的挥发物[23]，分别为乙酸己酯(纯度≥99.5%)、己二酸二异丁酯(纯度>99%)、邻苯二甲酸二异丁酯(纯度99%)、棕榈酸甲酯(纯度99%)、乙酸叶醇酯(纯度98%)、丙酸叶醇酯(纯度97%)、十四酸(纯度≥99.5%)、月桂酸(纯度98%)、罗勒烯(纯度>99.5%)、角鲨烯(纯度≥99.5%)、顺-3-己烯醇(纯度98%)、2-己基-1-葵醇(纯度98%)。根据寄主植物挥发物含量及同类实验，将各种标准品溶于液态石蜡中，将每个标样初步配制成浓度为2 mol/ L 的溶液，待用。

1.2 试验测定方法

1.2.1 糖槭挥发物的采集及分析鉴定

在哈尔滨市中山路行道绿化带，选择健康的糖槭进行采样，采用顶空吸附法将收集有糖槭挥发物的苏玛罐连接到7100 A预浓缩仪上(美国ENTECH公司)，浓缩后的样品采用气相色谱/质谱联用法分析 (gas chromatography/mass spectrum, GC/MS)[24-25]。其色谱柱为DB-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm。GC工作条件：升温程序为40 ℃恒温3 min，然后以10 ℃/min的速度升温到250 ℃，最后在250 ℃恒温5 min，溶剂延迟2 min。MS工作条件：离子源温度230 ℃，电离方式为E1源，离子能70 eV，质谱扫描范围为45～450 (m/z)。3次重复，1个空白对照，比对分析离子谱图获得挥发物组分。

1.2.2 EAG测定

参照范丽清等[17]和宁眺等[26]的方法略调整：以液态石蜡作为空白对照，各挥发物以液态石蜡为溶剂分别配制成浓度为2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，测试剂量为20 μL。将光肩星天牛成虫的雌、雄触角从基部剪下，并将触角末端的第1节切除，然后将触角两端分别与参考电极和记录电极上的导电针相连，调整气味管与触角间的距离。取 20 μL 待测试样品溶液滴在滤纸条(1.5 cm × 0.8 cm) 上，立即用镊子将滤纸条塞进干净的巴斯德管顶部，然后将样品管的末端连接到气体刺激装置，设定刺激气流流速为400 mL/min，持续气流流速为100 mL/min。待基线平稳后给予刺激。每个样品刺激时间为0.5 s，刺激间隔20 s。每个测试标样至少重复5 次，记录EAG反应值。

1.2.3 嗅觉行为反应的生物测定

采用“Y”型嗅觉仪测定光肩星天牛对糖槭挥发物主要成分的嗅觉行为[6,14,27-28]。各挥发物以液态石蜡为溶剂分别配制成浓度为2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，选取健康完好且活力较强的光肩星天牛成虫进行嗅觉行为测定，每次取 1 头进行行为选择测定，观察 3 min，对进入引诱臂和对照臂10 cm 以上且停留超过20 s 的分别记为光肩星天牛对气味源具有正趋向性和负趋向性，否则记为无反应。同一挥发物同一浓度对光肩星天牛嗅觉行为影响的测定，记为1组，每测完1组后，清洗干净并烘干，同时将引诱臂和对照臂互换，以消除实验环境对光肩星天牛嗅觉行为产生的影响，每种挥发物每个浓度测定10头天牛，重复5次。

引诱率和驱避率计算：引诱率=引诱臂内的总虫数/测试的总虫数 ×100%，驱避率=对照臂内的总虫数/测试的总虫数 ×100%。

1.3 数据处理

试验所得数据采用SPSS 19. 0进行分析，利用单因素方差Duncan多重比较法分别分析雌、雄光肩星天牛成虫对同种挥发物不同浓度EAG反应的差异显著性、同一挥发物不同浓度及同一浓度下不同挥发物引诱率的差异显著性，利用独立样本t检验分析同种挥发物在同一浓度下雌、雄光肩星天牛成虫EAG反应的差异显著性；用卡方检验分析同种挥发物在同一浓度分别对雌、雄光肩星天成虫嗅觉行为影响的差异显著性[29-31]。

2 结果与分析

2.1 糖槭挥发物的分析与鉴定

通过GC-MS对糖槭枝叶挥发物的分析和鉴定，共鉴定出7类34种挥发性化合物(表1)。

表1 糖槭挥发物组分

经鉴定，酯类17种、烷烃类5种、醇类4种、酸类4种、烯类2种、醛类1种、酮类1种。其中，酯类占61.67%，烯类占12.99%，酸类占5.58%，醇类占5.02%，烷烃类占1.54%，酮类占0.65%，醛类占0.60%，乙酸叶醇酯占比最高，为33.06%。

2.2 光肩星天牛对糖槭12种挥发物的EAG反应

经测定，光肩星天牛雌、雄成虫对糖槭的12种5个浓度挥发物的EAG反应，不仅在不同挥发物间存在差异，在同种挥发物不同浓度间也存在差异，见表2。

表2 光肩星天牛雌、雄成虫对12种糖槭挥发物的EAG反应及t检验

与对照相比较，同种挥发物不同浓度条件下，光肩星天牛雌成虫对5个浓度的乙酸己酯、乙酸叶醇酯、丙酸叶醇酯和顺-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的邻苯二甲酸二异丁酯和月桂酸，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二异丁酯、棕榈酸甲酯、2-己基-1-癸醇和罗勒烯，0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸和角鲨烯EAG反应差异显著(P<0.05，df=29，12种挥发物对应12个F值依次分别为9 046.72、4 058.39、2 321.24、1 695.25、3 3218.99、1 1981.50、5 068.37、4 461.78、1 0481.90、1 731.38、15 148.18和2 943.85)；雄成虫对5个浓度的乙酸己酯、乙酸叶醇酯和顺-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸甲酯、丙酸叶醇酯和角鲨烯，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸、月桂酸、罗勒烯和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L己二酸二异丁酯EAG反应差异显著(P<0.05，df=29，12种挥发物对应12个F值依次分别为：6 749.35、142.80、1 433.28、5 388.02、11 673.01、5 647.97、624.10、491.76、6 537.75、1 317.82、19 466.74和790.99)。雌、雄成虫对同种挥发物EAG反应相比较，在相同浓度下，雌成虫对乙酸己酯、己二酸二异丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、乙酸叶醇酯、丙酸叶醇酯、月桂酸和顺-3-己烯醇EAG反应均高于雄虫，且EAG反应与挥发物浓度呈正相关关系，随挥发物浓度的增加，EAG反应愈加明显；雄成虫对0.000 4和0.004 0 mol/L的罗勒烯和角鲨烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的2-己基-1-癸醇、0.000 4、0.004 0和0.040 0 mol/L的十四酸、0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的棕榈酸甲酯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鲨烯EAG反应均高于雌虫，雌、雄成虫对0.040 0 mol/L和 0.000 4 mol/L的角鲨烯EAG反应值相同，而各挥发物其余浓度处理的EAG反应均为雄虫低于雌虫。

独立样本t检验发现，同种挥发物同一浓度条件下，雌、雄光肩星天牛成虫EAG反应存在一定的差异(df=8，每种挥发物5个浓度，12种挥发物对应60个F值，依次分别为：0.118、0.889、0.057、0.508、1.237、0.257、0.020、2.667、0.227、0.011、2.541、1.419，5.434、0.962、0.411、0.382、0.940、2.909、0.132、0.012、0.008、1.753、0.014、0.158，0.084、0.200、2.400、0.573、7.656、0.400、0.566、0.691、0.159、5.158、0.086、1.455，1.070、4.872、0.364、0.008、0.620、0.311、2.163、0.000、1.185、0.242、0.597、5.333，0.118、1.258、0.117、6.400、1.525、0.311、1.151、2.939、1.455、0.042、7.100、7.692)，雌、雄成虫对0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯、乙酸叶醇酯和顺-3-己烯醇，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二异丁酯、丙酸叶醇酯、月桂酸和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L的棕榈酸甲酯和罗勒烯，0.004 0和2.000 0 mol/L的角鲨烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的十四酸、2.000 0 mol/L的邻苯二甲酸二异丁酯EAG反应差异极显著(P<0.01)，对0.000 4和0.004 0 mol/L的己二酸二异丁酯、0.000 4 mol/L的乙酸己酯和顺-3-己烯醇、0.004 0 mol/L的棕榈酸甲酯和丙酸叶醇酯、0.040 0和0.400 0 mol/L的邻苯二甲酸二异丁酯、0.040 0 mol/L和2.000 0 mol/L的十四酸、0.0400 0 mol/L的罗勒烯、0.400 0 mol/L的角鲨烯EAG反应差异显著(P<0.05)，对0.000 4和0.004 0 mol/L的邻苯二甲酸二异丁酯、月桂酸、罗勒烯和2-己基-1-癸醇、0.000 4 mol/L和0.040 0 mol/L的棕榈酸甲酯和角鲨烯、0.000 4 mol/L的乙酸叶醇酯、丙酸叶醇酯和十四酸EAG反应差异不显著(P>0.05)。

2.3 光肩星天牛对12种槭树挥发物的嗅觉行为反应

经测定，光肩星天牛雌、雄成虫对12种5个浓度糖槭挥发物的嗅觉行为反应，不仅在同一浓度不同挥发物间存在一定的差异，而且在同种挥发物不同浓度间也存在着一定的差异(表3)。

表3 光肩星天牛雌、雄成虫对12种糖槭挥发物的嗅觉行为反应

表3(续)

从表3可以看出，就光肩星天牛雌成虫而言，具有引诱作用的挥发物7种，具有驱避作用的挥发物2种，无引诱或驱避作用的挥发物3种。卡方检验(df=4)结果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸叶醇酯和丙酸叶醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和顺-3-己烯醇、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二异丁酯和2-己基-1-葵醇、2.000 0 mol/L的月桂酸均具有较强的引诱作用，引诱率与驱避率相比较差异极显著(P<0.01)；0.000 4 mol/L的乙酸叶醇酯和丙酸叶醇酯具有一定的引诱作用，引诱率与驱避率相比较差异显著(P<0.05)；0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的罗勒烯和0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的角鲨烯具有较强的驱避作用，驱避率与引诱率相比较差异极显著(P<0.01)。具有引诱或驱避作用的同一挥发物，引诱或驱避作用呈现出随浓度的增加而增强的现象，具有引诱或驱避作用的同一浓度不同挥发物也存在一定的差异。

从表3还可以看出，在实验选取的5个浓度测定范围内，对光肩星天牛雄虫具有引诱作用的挥发物有5种，具有驱避作用的挥发物有2种，无引诱或无驱避作用的挥发物有5种。卡方检验(df=4)结果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸叶醇酯和丙酸叶醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和顺-3-己烯醇、、0.400 0和2.000 0 mol/L的2-己基-1-癸醇，均具有较强的引诱作用，引诱率与驱避率相比，差异极显著(P<0.01)。0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的罗勒烯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鲨烯具有较强的驱避作用，驱避率与引诱率相比较差异极显著(P<0.01)；0.004 0 mol/L的罗勒烯具有一定的驱避作用，驱避率与引诱率相比较差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

植物挥发物通常为分子质量为100～200 u的有机化合物，包括烃类、烯类、酯类、醇类、有机酸类、酮类及芳香类化合物等物质，它们按一定的比例形成混合物对植食性昆虫产生嗅觉刺激，在植食性昆虫寄主选择过程中扮演者重要的角色[32-35]。本研究对糖槭挥发物分析鉴定结果表明，糖槭挥发物的主要成分与复叶槭、五角槭、华北五角槭及挪威槭挥发物主要成分具有明显的差异，复叶槭的主要成分为酯类、醛类、烷烃类和烯类，其中酯类占79.26%、醛类占9.47%、烷烃类占7.41%、烯类占3.2%；五角槭的主要为酯类和醛类，其中酯类占72.1%、醛类占10.15%、醇类占8.45%、烯类占6.55%、烷烃类占2.02%；华北五角槭的主要为酯类、烯类和醇类，其中酯类占62.08%、烯类占12.49%、醛类占11.72%、醇类占11.82%、烷烃类占1.05%；而挪威槭的主要为酯类、醛类和醇类，其中酯类占57.87%、醇类占21.68%、醛类占14.07%、酮类占3.7%、烯类占2.33%。醛类的含量越低，对光肩星天牛的引诱效果更好，醛类含量从小到大的树种顺序为：糖槭<复叶槭<五角枫<华北五角枫<挪威槭[6,14,19]。同时也发现，这些挥发物成分及其含量的差异是5种槭树感虫及其差异的原因[17]。

触角是昆虫的主要嗅觉器官，分布有不同类型的感器，不同类型的感器具有不同的功能，以帮助昆虫适地适时的完成特定的生物学行为，如栖息地的选择、寄主识别与定位、求偶、产卵等[36-37]。本研究结果显示，光肩星天牛雌、雄成虫对同一挥发物的EAG和嗅觉行为反应趋势基本上是一致的，在实验所设定的浓度范围内，随浓度的增加EAG和嗅觉行为反应也更加明显；但同浓度下雌、雄成虫间存在一定的差异，这种差异可能跟光肩星天牛雌、雄成虫触角上的感器数量及功能类别有关[17,38]。己二酸二异丁酯和月桂酸对光肩星天牛雌成虫具有引诱作用，对雄成虫无明显的趋性作用。在自然界，植物释放的信息化学物质是多种微浓度的气味物质的混合物，植物挥发物对植食性昆虫的引诱、驱避是多种气味物质协同作用的结果[17]。这两种挥发物是否与环境中复杂的气味源一起对雌性光肩星天牛成虫(有别于雄性光肩星天牛)在寄主植物上的生理功能(如产卵行为等)产生一定的调控作用，还需进一步研究。