表面活性剂对石油污染土壤生物修复的影响研究

＊邓春萍 肖鹏 崔学严 万利琼 郑舒丽 王林娟

（西南石油大学 四川 610500）

引言

由于过去数年间各大油田区采油工艺的相对落后和密闭性不佳，加之环境保护措施、意识和影响评价体系相对落后、污染控制和相应修复技术的缺乏，我国油田区土壤的石油污染程度远高于其他发达国家，土壤的石油污染呈逐年累积加重态势。目前，石油污染土壤严重影响了我国油田区的经济发展和生态环境，成为当地社会、经济和环境可持续发展最主要的制约因素。因此，石油污染土壤的修复，已经成为我国当前环境领域研究的焦点和亟待解决的重大环境问题之一[1]。

微生物法修复石油污染土壤，是指通过改变微生物外部生活环境和依照生物自身的遗传变异规律来提高石油降解速度和程度的一种修复方法[2]。石油烃污染物疏水性强，溶解度低，土壤中有机物质对石油烃有吸附作用，这些因素大大降低了土壤中石油的微生物可利用度，影响微生物修复效率[3]。采用表面活性剂提高污染物的溶解度是提高其生物可利用度的有效途径，微生物在生长过程中所分泌的生物表面活性剂因其具有较高的界面活化能力以及对环境无二次污染等特性，在提高污染物的生物可利用度方面得到越来越多的重视[4]。

2020年Xin Hu等人发现红球菌HX-2是生物表面活性剂的有效生产者，该表面活性剂表现出所需的生物修复特性。生物表面活性剂NK由于其在各种热、酸、碱和高盐条件下的稳定性而成为一种有吸引力的环境修复工具。与其他几种表面活性剂相比，它对石油和多环芳烃的溶解速度也很高，最重要的是它增强了微生物降解石油的能力[5]。2019年杨忠平等人提出表面活性剂强化修复技术（SER）可使地下环境中的污染物解吸和淋出，对去除砂土层残留态非水相液体（Nonaqueous Phase Liquids，NAPLs）具有显著效果，适合石油类污染的修复工作，但其解吸效率受土壤颗粒性质、孔隙度与渗透率等因素的限制，助驱能力存在极限，不能完全将土壤中的石油污染物洗脱[6]。2007年谭丽泉等人提出降解菌对表面活性剂的优先利用消耗了必要的养分,同时削弱了其增溶作用,因此抑制了多环芳烃（PAHs）的降解[7]。

总体来看，尽管当前对使用表面活性剂刺激石油土壤污染的生物修复有一定研究，但研究结果显示影响效果不确定，添加表面活性剂可能提高微生物修复效果，也可能对微生物具有一定的毒性，限制微生物修复。但关于表面活性剂对石油污染土壤生物修复效果的影响因素、内在机制的系统研究还不足[8]。为此，本文选用鼠李糖脂生物表面活性剂、β-环糊精、聚氧乙烯醚（Tween-80）、十二烷基硫酸钠（SDS）作为研究对象，研究表面活性剂对石油污染土壤生物修复的影响，并通过实验得出最优表面活性剂，并优化投放浓度，为表面活性剂强化生物修复石油污染土壤应用提供相关参考意见。

图1 含油率变化

1.材料与方法

(1)实验材料

供试土壤：清洁土壤（砂土）采自西南石油大学附近地区。

污染物：石油烃，取自中国石油化工有限公司。

石油降解菌：试验添加的石油降解菌为经富集和驯化的混合降解菌。

Tween-80：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

十二烷基硫酸钠（SDS）：纯度，AR，上海凛恩科技发展有限公司。

鼠李糖脂：纯度，≥95%，上海麦克林生化科技有限公司。

β-环糊精：纯度，≥95%，上海凛恩科技发展有限公司。

(2)实验方法

①土壤制备

前期的土壤准备，土壤选自本校的无污染土壤。收集好土壤之后，将土壤运回实验室，进行2周的晾晒，土壤去除根茎、树叶、碎石子等后经室内风干、破碎、研磨，过20目筛。通过筛子过筛得到干燥的较小颗粒土壤，后通过加入不同量的用石油醚溶解过的石油模拟不同浓度石油污染的土壤。首先，分别配制了石油质量占比为3%、5%、7%、9%的4个浓度梯度的石油污染土壤。

②无机培养基制备

取超纯水1L，NaNO31.5g，KCl 0.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.5g，K2HPO41g，CaCl20.002g，FeSO40.01g于锥形瓶中，调节溶液pH在7.0-7.2范围内，于121℃下灭菌20min。

③接种菌群

混合降解菌接种自油泥，并在模拟污染物（石油）为碳源的无机培养中富集和驯化培养。经菌种鉴定，混合降解菌主要包含寡养单胞菌属Stenotrophomonas、假单胞菌属Pseudomonas和芽胞杆菌属Bacillus。在无菌条件下向锥形瓶中加入配制好的无机盐培养基、1g原油并加入1%菌液，先用称量纸紧紧包住锥形瓶，后用报纸紧紧包住，放到摇床中，转速为140r/min，培养10天标记为母液。以母液为菌液重复以上步骤再制备5组。以100g为一份，将四种污染程度的土壤各分17份，装入相同的容器中。其中一份不加菌液也不加表面活性剂，只加入等量纯水为空白参照。而后将四种表面活性剂依次配制4组不同浓度的溶液。将配置好的16组溶液等量依次加入到每种污染程度的等量小份土壤中，半小时后接着向土壤中加入等量的菌液。为保证土壤中的菌液正常生长，每天加入适量的纯水。

④含油率测定

从每一种污染程度的土壤中取5g，测定并记录初始含油率，即第0天的含油率。之后每间隔5天，测定一次含油率，共测量记录4次。对比分析数据，分析降解菌对石油降解的作用情况、同样污染程度下不同表面活性剂的作用情况、不同污染程度下同一表面活性剂的作用情况、各种表面活性剂对于菌落降解石油的影响等。

2.结果与讨论

(1)原始污染土壤粒径占比

由表1原始污染土壤粒径占比可得，原始污染土壤中粒径在0.15mm-0.9mm的土壤占比64.6%，少部分土壤粒径在0.15mm以下，极少部分土壤粒径大于0.9mm。综合分析可得，实验使用土壤主要为沙土，土壤间隙较大，适合于好氧微生物生长以及土壤中石油烃的降解。

表1 原始污染土壤粒径占比（%）

(2)供试土壤指标

表2 供试土壤指标

根据土壤营养分级，土壤pH属于低碱性，有机质含量等级为中上，总氮含量等级为中等，碱解氮含量等级中上，总磷含量等级高，速效磷含量等级高，速效钾含量等级中上偏高，总体土壤营养环境较好，适合微生物的生长。

(3)含油率变化图

根据所得实验数据做出的图，分析可得表面活性剂的加入可以提高石油降解率。

根据所得实验数据做出的图，对原含油量为3%的数据组进分析：从第7天到第21天时，空白对照组（未接种也未加表面活性剂）含油量基本没有变化，加了1.7% SDS组含油量下降了59%，其次是5.1% SDS下降了41.9%。而0%和9.6% β-环糊精、0.45%和0.9%的tween80、0% SDS均只下降了24%左右。剩余的3.4% SDS、3.2% β-环糊精、1.35% tween80均只下降了16%左右。综上，得1.7%SDS效果最好。

根据所得实验数据做出的图，对原含油量为5%的数据组进分析：在7至21天土壤中的含油率均在下降，其中与0.76%鼠李糖脂效果最好，而0.38%鼠李糖脂次之。经过28天的实验后，发现鼠李糖脂效果最好，其中0.76%的鼠李糖脂对石油降解的效率最好,下降了约51.5%,而0%鼠李糖脂下降了48.1%，0.38%鼠李糖脂含油率下降了45.54%.由于实验操作中数据测量可能存在误差，导致部分数据并不准确，存在一定误差。总的来说，经过28天的观测，0.76%鼠李糖脂对石油含量5%的土壤降解效果最好。

根据所得实验数据做出的图，对原含油量为7%的数据组进分析：从图线总体趋势来看，空白对照组和0%的SDS组中含油率几乎没有变化；1.7%的SDS组含油率下降了5.36%、3.4%的SDS组下降了7.11%，此效果不如单一使用微生物时的效果，所以该种表面活性剂不建议使用，可能会抑制微生物的生长；6.4%的β-环糊精组下降了2.3%，可能是表面活性剂浓度过高抑制了微生物的生长、0.90%的tween80组下降了9.56%；0.38%的鼠李糖脂组和0.76%的鼠李糖脂组含油率下降幅度大，分别下降了40.4%和43.76%，大于不加表面活性剂对照，说明鼠李糖脂的加入促进了石油烃在土壤中的微生物修复。从各组最后的含油量与初始含油量的比较中可以得出，降低含油量效果最好的是，0.76%的鼠李糖脂，其次是0.38%的鼠李糖脂。不同的表面活性剂降低含油率效果不同，从实验数据可以看出，鼠李糖脂的效果＞tween80＞SDS＞β-环糊精。

根据所得实验数据做出的图，对原含油量为9%的数据组进分析：由图中曲线趋势可见，无论哪种表面活性都可使体系含油率下降，对比发现其中β-环糊精效果最好，SDS次之，最后是tween80，数据表明，浓度对表面活性剂有影响但并非单纯的线性关系，3.2%β环糊精效果最好，土壤含油率下降百分数为64%，其次是0.90%tween80，土壤含油率下降百分数为51%，其余土壤含油率下降百分数为40%左右，综上所述3.2%β-环糊精效果最好，其次是0.90%的tween80。

综上所述，0.38%的鼠李糖脂对石油含量7%的土壤降解效果最好，性价比最高，达到了40.4%，明显高于[9]中的19.5%，说明本实验的菌株与表面活性剂的浓度配比合适，对微生物修复的增强效果十分的明显。1.7%SDS组含油量下降了59%，明显高于[10]中的46%,S说明低浓度的SDS对土壤石油烃的微生物降解具有明显增强效果；3.2% β-环糊精对石油含量9%的土壤降解效果最好达到64%，明显高于[11]中的降解率45%。从四种表面活性剂下对比下可知，鼠李糖脂和β-环糊精作为一种可以增强微生物降解石油烃的表面活性剂，总体效果较好，并且明显的提高降解效果，值得思考的是，在以往研究中还有考虑土壤含水率的问题[12]，含水率对表面活性剂的增强效果也有巨大影响[12]，在后续实验可以探究含水率和菌种浓度对修复效果的影响。