乙醇浸提法提取红叶李中总黄酮工艺优化

程时劲，余 渤，毛 博，许星星，李安迪，刘晓霞

（武汉东湖学院生命科学与化学学院，武汉 430212）

红叶李又名紫叶李，属于蔷薇科李，是一种落叶小乔木，树体的高度最高达8 m 左右［1］。研究表明，红叶李中含有丰富的黄酮成分［2-4］，具有重要的研究与开发价值。黄酮类化合物常作为一些中草药的有效成分而被广泛研究，其中作为中药的活性成分大多存在于植物的叶片和花瓣中［5-7］。黄酮类化合物具有十分广泛的应用［8，9］，近年来黄酮类化合物主要应用在医药和化妆品方面，其中在医药方面有治疗肿瘤用药、消炎药、止疼药、降低血糖用药、胃药和护肝药等［10］；在护肤品方面主要应用这类化合物延缓老化和预防氧化的功能而开发高档护肤品类［11］。本研究对红叶李中总黄酮的提取工艺进行了优化，通过改变提取溶剂的类别，采用不同浓度的提取溶剂，改变料液比，改变提取温度和提取时间，分别在不同条件下测定总黄酮的提取率，得出最佳优化工艺条件。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、芦丁标准品（UV≥98%，上海金穗生物科技有限公司），以上试剂均为分析纯。

101-2AB 型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；天津市泰斯特仪器有限公司生产的FW135 型中草药粉碎机；UV-4802H 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.2 试验方法

将采摘好的红叶李叶片用自来水漂洗3 次，洗去表面的绿色虫卵及灰尘等，再用去离子水浸泡漂洗3 次，将洗净的叶片铺于洁净的纱布上置于烘箱中50℃10 h 烘至恒重，干燥后的叶片保存在密封袋中。用中草药粉碎机将叶片粉碎并过筛，将粉末保存在密封袋中备用。

分别称取5 份0.5 g 的红叶李粉末，按顺序倒入已编号的5 个250 mL 的烧杯中，往各个烧杯中分别加入去离子水、丙酮、石油醚、70%乙醇、乙酸乙酯30 mL。将所有样品置于60 ℃恒温水浴箱中浸提30 min。取出烧杯后过滤，用50 mL 的容量瓶收集滤液后70%乙醇定容得粗提液，将粗提液稀释10 倍得样品液。再取一个50 mL 容量瓶加入亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀后静置6 min；再依次加入10%A（lNO3）3溶液2 mL 和4%NaOH 溶液20 mL，用70%乙醇将其定容后摇匀放置15 min，得到参比液。在最大吸收波长处测量吸光度，然后计算出总黄酮的提取率。

按照上述方法，改变提取溶剂乙醇的浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%；改变料液比分别为 1∶15、1∶30、1∶45、1∶60（g∶mL）；改变提取温度分别为 40、50、60、70、80 ℃；改变浸提时间分别为10、30、50、70、90 min，再经过同样的处理和测试。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长和工作曲线

芦丁标准品与红叶李样品的最大吸收波峰所对应的波长相同，均为508 nm，因此确定测量的红叶李样品液吸光度的最大吸收波长为508 nm，并将其作为红叶李总黄酮含量的测定波长，如图1 所示。用紫外可见分光光度计在最大吸收波长处测定标准溶液的吸光度，绘制标准溶液的工作曲线，如图2 所示，工作曲线回归方程为Y=0.011 28X+0.034 77，R2=0.999 34。结果表明，标准溶液浓度在 8～48 mg∕mL范围内，红叶李的吸光度与浓度呈良好的线性关系。

图1 芦丁标准品紫外可见光谱

图2 标准溶液的工作曲线

2.2 总黄酮提取率的计算

将测出的样品溶液吸光度代入标准回归方程中算出样品溶液中总黄酮的浓度，然后根据稀释的倍数反算出提取的总黄酮质量，与所取的红叶李粉末质量相比即可得出提取率，其计算公式为：Q=（C×V×10∕m）×100%

式中，Q为总黄酮提取率（%）；m为红叶李叶片粉末质量（g）；C为总黄酮浓度（mg∕mL）；V为粗提液稀释后的体积（mL）。

2.3 提取溶剂及其浓度优化

选用不同提取溶剂将红叶李粉末在60 ℃水浴锅中浸提30 min，不同溶剂提取后红叶李样品溶液的提取率如图3 所示。由图3 可知，红叶李总黄酮提取率高低依次为70%乙醇、丙酮、去离子水、石油醚、乙酸乙酯，所以选择70%乙醇为提取溶剂。

图3 不同提取溶剂下总黄酮提取率

选用不同浓度的乙醇将红叶李粉末置于60 ℃恒温水浴箱中浸提30 min，经不同浓度乙醇溶液提取后红叶李样品溶液的提取率如图4 所示。由图4可知，当乙醇浓度小于70%时，红叶李中总黄酮的提取率随着乙醇浓度增大而上升，当乙醇浓度超过70%时提取率反而下降，所以最佳的乙醇提取浓度为70%。

2.4 料液比的优化

图4 提取率随乙醇浓度变化情况

选用几种不同料液比的70%乙醇溶液与红叶李粉末放入60℃的恒温水浴箱中浸提30 min，料液比不同，总黄酮的提取率也不同，提取率与料液比的关系曲线见图5。由图5 可知，红叶李中总黄酮的提取率随着溶剂量的增加而呈上升趋势，在料液比小于1∶45 时上升明显，而在料液比超过1∶45 时上升幅度趋于平缓。考虑到溶剂量再继续增大会消耗更多的提取试液和提取时间，提取效率增长甚微，所以选择1∶45 为提取红叶李中总黄酮的最佳料液比。

图5 总黄酮提取率与料液比的关系曲线

2.5 提取温度的优化

将料液比为1∶45 的70%乙醇溶液浸提的红叶李粉末置于温度不同的恒温水浴箱中浸提30 min，改变提取温度，样品的总黄酮提取率也随之发生变化，提取率与温度之间的关系见图6。由图6 可知，40～70 ℃，总黄酮提取率随着温度的增加而上升；70～80 ℃，提取率随着温度的增加而下降，所以选择70 ℃为乙醇浸提法提取红叶李中总黄酮的最佳提取温度。

图6 总黄酮提取率随温度上升的变化趋势

2.6 提取时间的优化

选用70%的乙醇溶液，料液比为1∶45，在温度为70 ℃的恒温水浴箱中浸提不同时间后红叶李样品溶液的总黄酮提取率如图7 所示。由图7 可知，乙醇浸提法提取红叶李中总黄酮的提取率随提取时间的增加而上升，但在提取时间超过70 min 之后提取率上升趋势趋于平缓，故为了提高试验效率，选择70 min 为最佳提取时间，此时提取率为8.24%。

图7 总黄酮提取率随提取时间变化情况

3 小结

本试验以新鲜红叶李叶片低温烘干研磨后的粉末为原料，研究探讨了红叶李叶片总黄酮提取工艺的优化条件。采取了乙醇浸取法提取红叶李中的总黄酮，通过改变提取溶剂的种类、采用不同提取溶剂的浓度，改变料液比，在不同的提取温度和提取时间下测定提取率，最终确定了红叶李总黄酮提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度为70%，料液比为1∶45，在70℃的恒温水浴箱中浸提70 min，此时红叶李中的总黄酮提取率最高，可达8.24%。