柔肝化纤颗粒对代偿期乙肝肝硬化肝肾阴虚型患者外周血NLRP3炎症小体及其产物表达的影响

段桂姣，王振常，蒋锐沅，郝蔷薇，吕艳杭，农小欣

(1.广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530299；2.广西中医药大学附属国际壮医医院，广西 南宁 530001)

乙肝肝硬化是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染导致肝内淋巴细胞增加，产生大量细胞因子及炎症介质，肝细胞变性坏死，引起结缔组织增生、假小叶形成的一种病理变化。我国属慢性肝病大国，其中慢性乙肝患者占3 000万人，约30%可发展为肝硬化，若治疗不及时可出现上消化道出血等并发症，严重危及患者生命[1]。恩替卡韦能有效抑制HBV的复制，减少肝脏炎症的损伤，但在抗肝纤维化方面作用不显著[2-3]。因此如何有效防治乙肝肝硬化的进展已成为临床的重点及难点问题。实验研究发现，减轻肝脏炎症反应是逆转肝纤维化、延缓肝病进展的重要措施[4]。目前乙肝肝硬化外周血中核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白(Nucleotide oligomerization structural domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体的表达水平与肝脏炎症因子的关系还有待深入研究。本研究通过观察柔肝化纤颗粒联合恩替卡韦对代偿期乙肝肝硬化肝肾阴虚型患者的临床疗效和NLRP3炎症小体及其产物影响,探索中西医联合治疗代偿期乙肝肝硬化的有效途径。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取广西中医药大学附属国际壮医医院门诊2017年12月至2019年12月治疗的80例代偿期乙肝肝硬化肝肾阴虚型患者，随机分为治疗组和对照组各40例。其中对照组男27例，女13例；年龄18～70岁，平均年龄(40.53±9.08)岁；病程1～16 a，平均病程(8.71±2.91)a；Child-Pugh评分(8.18±1.28)分。治疗组男22例，女18例；年龄18～65岁，平均年龄(40.62±9.12)岁；病程1～15 a，平均病程(8.73±3.01)a；Child-Pugh评分(8.08±1.21)分。2组患者性别、年龄、病程、Child-Pugh评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，2组具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准(伦理号：KY20170110)。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 2组患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[5]及《肝硬化中西医结合诊疗共识》[6]诊断标准：①HBsAg、HBV-DNA阳性6个月以上；②HBeAg阳性、血清谷草转氨酶(Alanine aminotrans,ALT)持续或反复异常；③瞬时弹性成像(Transientelastography，TE)检测肝脏硬度值≥17.5 kPa；④符合HBV感染抗病毒的适应证；⑤表现轻度乏力, 食欲减少或腹胀、腹泻、上腹隐痛等症状；⑥Child-Pugh分级为A级；⑦B超提示肝脏肿大，形态失常，表面欠平整，且各切面、径线也有增大等表现。

1.2.2 中医诊断标准 2组患者均符合《中药新药临床研究指导原则》[7]中“癥积-肝肾阴虚证”主症：①腰酸腿痛；②胁肋隐痛；③五心烦热。次症：①耳鸣耳聋；②头晕眼花；③口干咽燥。舌红少苔，脉细或细数。同时具备2项主症或2项主症伴随1项次症，同时结合舌脉，由2名副主任及以上级别中医医师可确诊为此证。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①符合上述西医及中医证候诊断标准；②年龄在18～70周岁；③入组患者为乙肝肝硬化代偿期；④近6个月内未服用任何抗病毒、抗肝纤维化及免疫调节剂；⑤患者自愿参加,并签署知情同意书。

排除标准：①合并有其他脏器功能损害者，或有精神疾病、甲型及丙型肝炎病史者；②孕妇、哺乳期或备孕计划者；③已知对本次所用药物过敏者。

1.4 脱落及剔除标准

①未按照实验方案用药或中途改用其他药物治疗者；②未能完成实验方案或中途退出者；③治疗期间出现严重不良反应者。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组：根据《慢性乙型肝炎防治指南》[5]予空腹口服恩替卡韦分散片(正大天晴药业集团股份有限公司，0.5 mg/片)，0.5 mg/次，1次/d。

治疗组：在对照组治疗基础上，加用柔肝化纤颗粒治疗。药用黄芪15 g,薏苡仁15 g,黄精30 g,枸杞子30 g,大枣20 g，牡蛎20 g，鳖甲15 g，泽兰20 g，鸡内金10 g，橘红10 g，虎杖20 g，牡丹皮20 g。由我院制剂室制备成免煎颗粒，每日1剂，兑温水冲服200 mL,早晚饭后分服。

2组疗程均为24周。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 中医证候积分 参考《中药新药临床研究指导原则》[7]中乙肝肝硬化肝肾阴虚型证候标准,主症腰酸腿痛、胁肋隐痛、五心烦热。次症耳鸣耳聋、头晕眼花、口干咽燥。根据病情无、轻、中、重标准分别积分,制定中医证候积分量表。其中无自觉症状记0分；症状较轻,能日常生活记1分；症状中等,影响部分日常生活记2分；症状较重,不能坚持正常工作记3分。积分越高,症状越重。

2.2.2 临床疗效评价 参考文献[7]制定。尼莫地平法计算，疗效指数=(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100% 。治愈：临床疗效消失或基本消失，肝功能基本正常，肝纤维化指标较前下降>75%；显效：临床症状明显改善，肝功能恢复正常，肝纤维化指标较治疗前下降>50%，≤75%；有效：临床症状明显好转，肝功能接近正常或较治疗前下降>25%，肝纤维化指标较治疗前下降>25%，≤50%；无效：未达有效标准或恶化。

2.2.3 实验室指标测定 治疗前后采集2组患者清晨空腹外周静脉血5 mL，KH20R-Ⅱ型低温冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)以3 000 r/min离心10 min取血清，分装保存于-80 ℃冰箱待用。

(1)肝功能和肝纤维化指标检测。采用ELISA法检测血清ALT、谷丙转氨酶(Asprtate transaminase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)水平。试剂盒由上海透景诊断科技有限公司提供，检测仪器为BK-400型全自动生化分析仪(武汉科尔达医疗科技有限公司)。

采用ELISA法测定血清Ⅲ型前胶原(Procoagen typeⅢ protein, PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(CollagenⅣ,Ⅳ-C)、层黏蛋白(Laninin,LN)、透明质酸(Hyaluronic acid,HA)水平。试剂盒由上海拜力生物科技有限公司提供，检测仪器为AE-180型全自动化学发光免疫分析仪(上海寰熙医疗器械有限公司)。具体操作均严格按照说明书进行。

(2)HBV-DNA水平检测。采用荧光定量PCR法检测并比较治疗前后患者HBV-DNA水平。HBV-DNA定量检测试剂盒(货号：3400175)由中山医科大学达安基因股份有限公司提供，检测仪器为LightCycler480II荧光定量PCR仪(上海智岩科学仪器有限公司)，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。

(3)炎性因子水平检测。采用ELISA法检测外周血IL-1β、IL-18及TNF-α表达水平。将待测血清每孔加入100 μL，分别加入生物素标记抗体、过氧化物酶标记亲和素、底物溶液及终止液充分反应后，于5 min内在450 nm波长Varioskan LUX型酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)中检测。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，操作严格按照说明书进行。

(4)血清NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA水平检测。运用Trizol法提取患者总RNA，测定RNA浓度，然后按逆转录试剂盒(Takara公司提供，货号：RR036A)说明书进行逆转录。结果分析：以GAPDH为内参，荧光定量PCR法检测各基因mRNA的表达量。计算各组相应基因的2-ΔΔCT值。以目的基因的量为定量结果进行统计学分析。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR实验所用引物序列

2.2.4 肝脾影像学检查 治疗前后采用DW-T5型彩色多普勒超声仪(江苏大为医疗有限公司)检测患者脾厚度、门静脉内径(Dpv)、脾静脉内径(Dsv)。

2.2.5 安全性评价 治疗前后入院患者分别检测血常规、尿常规、粪便常规、肝肾功能、心电图等项目。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 2组患者治疗前后中医证候积分比较

结果见表2。

表2 2组患者治疗前后中医证候积分比较

3.2 2组患者治疗前后肝功能指标比较

结果见表3。

表3 2组患者治疗前后肝功能指标比较

3.3 2组患者治疗前后肝纤四项水平比较

结果见表4。

表4 2组患者治疗前后肝纤四项水平比较

3.4 2组患者治疗前后肝脾影像学指标及血清HBV-DNA水平比较

结果见表5。

表5 2组患者治疗前后脾厚度、Dpv、Dsv及血清HBV-DNA水平比较

3.5 2组患者治疗前后血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平比较

结果见表6。

表6 2组患者治疗前后血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平比较

3.6 2组患者治疗前后NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表达水平比较

结果见表7。

表7 2组患者治疗前后NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表达比较

3.7 2组患者临床疗效比较

结果见表8。

表8 2组患者临床疗效比较(n=40)

3.8 2组患者安全性评价

治疗期间，对照组出现1例腹泻，未予处理，2 d后症状自行消失；其他患者三大常规、肝肾功能、心电图均无异常表现。

4 讨论

乙肝肝硬化归属于中医学 “鼓胀”范畴。其主要病理为进行性的肝纤维化。肝纤维化与机体罹患病毒性肝炎、免疫功能紊乱、炎症因子刺激、酒精中毒、氧化应激反应等多种因素有关。因此，现代医学治疗以抗病毒、调节免疫、抗肝纤维化、抗炎及积极预防并发症为主。

乙肝肝硬化大多起病隐匿，不易发现，容易错过最佳治疗时间。大量研究证实，NLRP3炎症小体是肝脏炎症反应的关键调控因子，通过激活Caspase-1导致IL-1β、IL-18等促炎细胞因子过分泌，引起机体炎症反应，介导肝纤维化的形成[8]。研究发现，在慢性肝损伤过程中伴随着NLRP3炎症小体及其相关促炎因子mRNA和蛋白表达水平的上升[9]。同时研究发现，肝损伤过程中活化的炎症小体能引起正常肝细胞焦亡，加重肝损程度及机体炎症反应[10]。可见，抑制炎症小体的活化在治疗慢性肝病中意义重大。

多项研究证实，中医药能抑制乙肝病毒复制水平、延缓肝纤维化进展、多途径干预治疗肝硬化[11]。导师王振常教授认为机体正虚，湿热疫毒之邪凝聚肝经，出现肝气郁结，气滞血瘀，湿热凝聚成痰，阻滞肝脉血络，肝失疏泄可克脾土，脾之运化不畅可克肾水，最终导致肝肾阴虚。这与著名肝病大家关幼波教授对鼓胀的认识相一致[12]。因此，柔肝健脾补肾的同时，还应兼顾滋阴。

柔肝化纤颗粒是导师王振常教授在全国名老中医林沛湘教授治疗慢性肝炎、肝炎肝硬化的有效经验方“壮肝逐瘀煎”原方进行拆分分组，并在此基础上优化其配伍而来[13]。前期课题组研究发现，在治疗乙肝肝硬化及肝纤维化患者中加用柔肝化纤颗粒，能有效改善肝功能及临床疗效，降低肝脏炎症反应[14-16]。柔肝化纤颗粒由黄芪、薏苡仁、黄精、枸杞子、大枣、牡蛎、鳖甲、泽兰、鸡内金、橘红、虎杖、牡丹皮组成。方中黄芪益气固表止汗，为补气升阳之要药；黄精健脾益肾，补气滋阴；枸杞子滋补肝肾，三药合用养肝肾，补肝阴。牡蛎、鳖甲滋阴潜阳、软坚散结，二药滋水涵木，使肝木和，肾水调。薏苡仁、橘红、鸡内金、大枣健脾，四药合用健脾益气、燥湿化痰。泽兰、虎杖、牡丹皮活血化瘀、清热解毒。全方共奏补肝肾、活血化瘀、软坚化痰之功。

现代药理学研究表明，黄芪甲苷通过抑制NLRP3炎症小体下游因子IL-1β表达，降低炎症反应[17]。薏苡仁蛋白调控IκK/NF-κB信号通路的活化，降低炎症反应[18]。黄精、枸杞子能提高机体免疫力、抗肿瘤。大枣多糖能抑制促炎因子IL-6表达，起到抗炎的作用[19]。牡蛎、泽兰、虎杖、牡丹皮、鸡内金、橘红、鳖甲具有提高免疫力、抗病毒、抗炎等多种药理学作用[20-22]。

最新研究表明[23]通过抑制NLRP3炎性小体的活化，能有效抑制其下游因子的炎症级联反应，改善炎症相关性疾病的预后。本研究结果显示，治疗组血清NLRP3 炎症小体及其产物IL-1β、Caspase-1、IL-18 水平均较对照组显著下降，提示柔肝化纤颗粒辅助治疗疗效显著，可能是其通过未知的相关炎症因子介导免疫稳态。因此，进一步深入研究NLRP3炎症小体及其下游炎症效应因子在慢性肝炎、肝硬化的形成过程中的作用机制刻不容缓。同时，彩超结果显示Dpv、Dsv、脾厚度均下降，提示联合用药可使Dpv、Dsv缩小，脾脏回缩。HBV-DNA水平明显降低，提示联合用药能有效抑制HBV多聚酶活性及复制。治疗后ALT、AST、TBIL水平及肝纤维化指标均显著下降，ALB水平升高，表明联合柔肝化纤颗粒能明显改善肝脏功能、肝纤四项水平，一定程度逆转早期肝硬化的进展。

综上所述，柔肝化纤颗粒治疗乙肝肝硬化疗效明确，能有效改善肝功能，提高HBV-DNA转阴率水平，降低Dpv、Dsv、脾厚度，其作用机制可能是通过抑制血清NLRP3炎症小体表达及下游炎性因子活化、分泌，减轻肝细胞受损程度，减轻机体炎症反应。血清NLRP3炎症小体、Caspase-1及下游炎性因子IL-1β、IL-18在参与慢性肝病的发生发展中意义重大, 但具体机制有待进一步研究。