回药扎里奴思方UPLC指纹图谱结合多成分含量测定的质控方法研究

黄楷迪，刘敬霞，牛阳，马学琴，张婷，卜凡淑，任慧，郭盛，钱大玮，段金廒

(1.南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004；3.南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

《回回药方》是一部内容丰富的中国回族医药学大型综合性典籍。扎里奴思方出自其残卷十二《众风门》，原文谓此方“治口眼歪斜，痰胜，弱病净其浑身，厚浊风痰，开窍，治频频淋下，半身不遂，脑病头疼用”[1]，有芳香开窍，化痰祛瘀，补肾益髓的功效[2]。本研究所用方为扎里奴思方的改良方，由安息香、石菖蒲、红花、杜仲、乳香、当归、牡丹皮、淫羊藿、大黄、怀牛膝、海风藤、没药共12味药材组成。该方在宁夏回族地区使用较为广泛，在临床上常用于中风、脑梗死[3]等脑部疾病的治疗。

目前扎里奴思方的研究仅限于药效学方面[4-5]，少有相关质量控制研究的报道。为了阐明其作用的药效物质基础，提高临床用药的质量与安全性，进一步促进该方在临床治疗中的广泛应用。本实验采用UPLC-PDA建立扎里奴思方指纹图谱，通过对照品比对，归属各成分药材来源，并在此基础上进行多指标成分的含量测定，为扎里奴思方进一步的深入研究及其新药研发提供依据[6]。

1 材料

ACQUITY UHPLC(2695分离单元，2998二极管阵列检测器，Empower色谱数据工作站，Waters公司)；ML204(十万分之一)、MS105(万分之一)电子分析天平(梅特勒-托尼多仪器有限公司)；EPED超纯水系统(南京易普易达科技发展有限公司)；D2012高速台式离心机(大龙兴创实验仪器北京有限公司)；KQ-250E超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；冷冻干燥机(LABCONCO公司)。

对照品没食子酸(批号：110831-201605)购于中国食品药品检定研究院，对照品绿原酸(批号：Y24J7K16726)、羟基红花黄色素A(批号：R31A9F69105)、阿魏酸(批号：wkq17112012)、朝藿定B(批号：P25F8F30154)、淫羊藿苷(批号：T21S8B40472)、β-细辛醚(批号：J19O8T45985)、肉桂酸(批号：AA0806LB14)购于上海源叶生物科技有限公司，对照品丹皮酚(批号：DPF20160828)购于南京春秋生物工程有限公司；纯度均≥98%。甲酸、乙腈均为色谱纯。

安息香、石菖蒲、红花、杜仲、乳香、当归、牡丹皮、淫羊藿、大黄、怀牛膝、海风藤、没药药材均购自亳州市紫锐药业有限公司，经南京中医药大学严辉副教授鉴定，各项检查均符合2015版《中国药典》。各药材具体信息见表1。将各味药材根据批号随机混合制备10批供试样品。

表1 药材具体信息表

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件

Waters ACQUITY UHPLC T3(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱，柱温30 ℃，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序为：0～3 min，0%～2%A；3～5 min，2%～3%A；5～8 min，3%～5%A；8～25 min，5%～7%A；25～35 min，7%A；35～43 min，7%～10%A；43～65 min，10%～20%A；65～70 min，20%A；70～90 min，20%～25%A；90～120 min，25%～60%A；120～125 min，60%～95%A；流速0.4 mL/min；进样体积7 μL；检测波长317 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照溶液的制备 分别取没食子酸、朝藿定B、淫羊藿苷、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、绿原酸、羟基红花黄色素A、β-细辛醚适量，精密称定，加甲醇配制成各对照品储备液。分别取适量储备液，加于同一容量瓶中，加甲醇定容并混合均匀，得质量浓度分别为1.540 mg/mL、46.98 μg/mL、178.4 μg/mL、26.13 μg/mL、1.730 mg/mL、46.98 μg/mL、30.96 μg/mL、1.220 mg/mL、106.3 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 按处方比例称取各味药材，加水回流提取3次，过滤提取液，滤液经浓缩后冷冻干燥，粉碎后得固体粉末。精密称取各样品0.5 g，加入20 mL 70%甲醇溶液，称质量，超声提取30 min后，加70%甲醇补足减失质量，提取液离心(13 000 r/min，10 min)，取上清液10 mL浓缩后用70%甲醇定容至5 mL容量瓶中，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液进行测定。

2.2.3 单味药供试品溶液的制备 按照处方量分别称取各单味药材，按“2.2.2”项下方法制备各单味药材供试品溶液。

2.2.4 阴性对照供试品溶液的制备 按照处方量分别称取缺失安息香、石菖蒲、红花、杜仲、乳香、当归、牡丹皮、淫羊藿、大黄、怀牛膝、海风藤、没药药材的复方，按照“2.2.2”项下方法制备各药材阴性对照供试品溶液。

2.3 扎里奴思方指纹图谱的建立

2.3.1 精密度实验 称取同一批供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试液，按照“2.1”项下色谱条件连续测定6次，记录色谱图。以5号峰阿魏酸为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.6%(n=6)，相对峰面积的RSD值均小于1.9%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.3.2 重复性实验 称取同一批供试品共6份，并按“2.2.2”项下方法制备，在“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以5号峰阿魏酸为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.8%(n=6)，相对峰面积的RSD值均小于2.3%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.3.3 稳定性实验 称取同一批供试品，并按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以5号峰阿魏酸为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1.2%(n=6)，相对峰面积的RSD值均小于2.2%(n=6)，表明本方法稳定性良好。

2.3.4 建立指纹图谱与生成对照图谱 将各药材混合搭配的10批自制样品按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件检测，记录10批样品色谱图。将色谱图结果依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，对各指纹图谱色谱峰进行多点校正，并自动匹配生成指纹图谱共有模式。结果如图1～2。共获得13个共有峰，其中5号峰阿魏酸分离度佳，峰面积较大，并且为当归药材的药典规定指标成分[7]，故选择其为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，13个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.13%，表明各成分出峰时间相对稳定，但相对峰面积RSD差异较大，表明各成分含量之间存在一定差异，结果见表2～3。

注：1.没食子酸;2.绿原酸;3.羟基红花黄色素A;5.阿魏酸; 7.肉桂酸;8.丹皮酚;9.朝藿定B;10.淫羊藿苷;11.β-细辛醚图1 对照指纹图谱

2.3.5 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对10批样品的指纹图谱和对照图谱进行相似度计算，相似度分别为0.923、0.959、0.983、0.964、0.937、0.937、0.971、0.980、0.978、0.981，结果可见各批样品间一致性较好。

2.3.6 共有峰的指认及色谱峰的归属 分别精密吸取全方供试品溶液、各单味药材供试品溶液以及各药材阴性对照供试品溶液，按照“2.1”项下色谱方法进行测定，记录色谱图，如图3～4所示。对各峰进行编号及比对，结合各单味药材及阴性对照药材图谱可知，1、8号峰主要来自牡丹皮，2号峰来自杜仲，3、4号峰主要来自红花，5号峰来自当归，7号峰主要来自安息香，9、10号峰来自淫羊藿，11号峰来自石菖蒲，12号峰来自没药，13号峰来自乳香。

注：R.对照图谱；S1～S10.10批自制样品UPLC色谱图

表2 10批样品指纹图谱共有峰相对保留时间

表3 10批样品指纹图谱共有峰相对峰面积

结果发现药材怀牛膝并未对共有峰做出贡献，其主要成分为甾酮及皂苷类成分，在处方中可能起到对其它成分的助溶作用。药材海风藤主要成分为五味子酯甲、五味子乙素等物质，该类物质在药材中含量较低且极性较小，用一般方式较难提取，故并未对共有峰做出贡献。

为了更加明确各共有峰，采用对照品进行比对，确定1～3号峰分别为没食子酸、绿原酸以及羟基红花黄色素A，5号峰为阿魏酸，7～11号峰分别为肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷以及β-细辛醚。

图3 单味药材共有峰归属UPLC色谱图

图4 全方样品(A)、混合对照品(B)以及阴性对照品(C) UPLC色谱图

2.4 扎里奴思方9种成分的含量测定

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，用甲醇逐步稀释，配成系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以被测物质质量浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并计算回归方程及相关系数r，结果见表4。

表4 9种成分的回归方程和线性范围

2.4.2 精密度实验 精密吸取中等质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，共平行测定6次，分别计算各峰面积。没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-细辛醚6次进样峰面积的RSD值为0.51%、0.93%、0.15%、0.53%、0.15%、0.37%、0.55%、0.49%、0.19%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性实验 称取同一批供试品，并按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算峰面积。没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-细辛醚6次进样峰面积的RSD值为0.86%、1.17%、0.54%、0.84%、0.61%、0.62%、0.75%、0.66%、0.69%(n=6)，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性实验 精密称取同一批供试品共6份，并按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，共平行测定6次，分别计算各物质含量。没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-细辛醚含量的RSD值为1.20%、1.14%、1.66%、0.81%、1.57%、1.23%、1.30%、0.66%、1.32%(n=6)，说明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率实验 精密称取0.25 g已知含量的S1号样品6份，分别精密加入对照品溶液(0.85 mg/mL没食子酸1.5 mL，0.04 mg/mL绿原酸1 mL，0.80 mg/mL羟基红花黄色素A 1 mL，0.05 mg/mL阿魏酸1 mL，0.075 mg/mL丹皮酚1 mL，1.50 mg/mL肉桂酸1.5 mL，0.25 mg/mL淫羊藿苷1 mL，0.075 mg/mL朝藿定B 1 mL，0.15 mg/mLβ-细辛醚1 mL)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算各成分6次测定平均回收率和RSD值，平均回收率分别为100.08%、99.62%、100.03%、101.13%、101.04%、100.99%、102.76%、102.91%、98.82%，RSD值分别为1.19%、2.45%、1.11%、2.17%、2.08%、1.05%、2.52%、1.83%、2.13%。结果表明该方法准确度良好。

2.4.6 含量测定结果 精密称取10批样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试液，按照“2.1”项下色谱条件，分别测定10批样品冻干粉中9种成分含量，结果见表5。

表5 10批样品粉末中9种成分含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

本实验对供试品冻干粉采用30%、50%、70%甲醇作为提取溶剂，考察了不同浓度甲醇对供试品冻干粉提取效果的影响。其中药材大黄主要成分为蒽醌类物质，对于该类物质的测定，供试品前处理方法较为复杂，与其他几味药材处理方式差异较大，为了尽可能多地体现复方中各味药材特征，选用适合大部分药材的处理方法。最终发现70%甲醇提取最为完全，可提供色谱信息较多，故选择70%甲醇提取。

考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等流动相洗脱体系，结果表明甲酸水溶液体系有助于各成分的分离；乙腈体系基线平稳，能缩短分析时间，综上，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相。考察不同柱温(25、30、35 ℃)对各成分分离的影响，发现25 ℃时，各成分在色谱柱中的洗脱减缓，延长了分析时间；而35 ℃时部分色谱峰峰形不佳，最终选择30 ℃。进一步对扎里奴思方各成分最佳吸收波长进行考察，分别考察了254、280、317 nm波长，结果发现，波长在317 nm时，峰高适中，出现的色谱峰最多，分离度最佳，故采用317 nm波长进行测定。

含量测定结果显示，同一成分在不同批次间的含量具有一定差异，说明药材的不同采收期及储存条件都会对成分含量造成一定影响。应首先保证药材质量，才能进一步确保临床疗效。中药复方制剂的优势是多成分、多靶点协同发挥药效[8]，在建立复方指纹图谱时应综合各种物质化学信息，尽可能地反映复方的化学成分特征。本实验共确定了13个共有峰，分别来自牡丹皮、杜仲、红花、当归、安息香、淫羊藿、石菖蒲及乳香8味药材，具有一定代表性。在后续的研究中应将传统方法与药效学方法结合起来，才能更好地保证复方的安全性与有效性[9]。

本实验首次建立了回药扎里奴思方指纹图谱及多指标成分含量的测定方法，采用对照品比较，指认并归属各共有峰。测定了该方中没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-细辛醚的含量。从指纹图谱与含量测定两个方面对复方进行了整体质量评价，为完善其质量控制和进一步新药研发提供依据。