盐度胁迫对缢蛏血液离子浓度及碳酸酐酶基因表达的影响

陈 铭，林志华，徐 娴，何 琳

(1.浙江万里学院 生物与环境学院 浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室，宁波 315100；2.浙江万里学院 宁海海洋生物种业研究院，宁波 315100；3.宁波大学 海洋学院，宁波 315100)

缢蛏(Sinonovaulaconstricta)为广温广盐性双壳类软体动物，栖息于潮间带的沙泥中，广泛分布于我国的沿海地区，是我国传统四大养殖贝类之一，我国的养殖历史已有数百年。夏季高温、台风暴雨等天气环境的影响使得滩涂水域环境温度和盐度变化剧烈。近岸潮间带的海洋生物需要通过调节离子浓度以及保证机体内的水分和盐类的代谢处于稳定状态来保持稳定的渗透压[1-2]。

本文探讨5种盐度对缢蛏血液Na+、K+和Cl-离子含量的影响，确定盐度突变过程中缢蛏生理生化方面的变化特征；并采用实时荧光定量PCR 技术，检测CA基因在缢蛏不同组织以及不同浓度盐度胁迫的表达分析，探索CA基因在缢蛏急性盐度胁迫过程中的作用，为缢蛏在适应盐度环境变化的分子生理机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用缢蛏为浙江省宁波市本地群体，去除其表面附着物，挑选规格均匀，体色正常，体质健康的个体，个体质量为(10.4±1.4)g。实验前暂养在循环养殖水族箱中7 d，海水盐度为20，温度为20 ℃，pH 8.1，连续充气，每日换水1次，换水量为1/2，并投喂适量的金藻，使其适应实验室环境。

1.2 方法

1.2.1 血液Na+、K+和Cl-浓度的测定

实验设计5组，分别为对照组(盐度为20)；低盐组2组(盐度为5和15)；高盐组2组(盐度为25和35)，每组12个缢蛏，重复实验2次，实验前1天停止喂食，实验开始时将缢蛏从海水中移至各浓度实验组中。实验胁迫后4、8、12、24、48、72和96 h 采集血样，用1 mL 一次性无菌注射器从闭壳肌抽取血液置于1.5 mL离心管中，3 000 r/min离心5 min，吸取上清液1 mL，与2 mL的双氧水和5 mL优级纯的浓硝酸混合，放入微波消解仪，180 ℃消解20 min。将消解过后的液体定容到50 mL的容量瓶(用稀硝酸或者超纯水定容)中。电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测Na+和K+。Cl-的检测按照南京建成试剂盒的说明书操作。

1.2.2CA基因的克隆

缢蛏暂养1周后活体解剖，取其鳃用于cDNA克隆，将鳃放在液氮中速冻后用Trizol提取总RNA，检测RNA 浓度和A260/A280以及A260/A230值。用SMARTTMRACE DNA AmplicationKit试剂盒(Clontech)合成cDNA第一链，作为cDNA末端快速扩增技术(RACE)的模板。参照缢蛏已有转录组文库中的CA基因EST片段，用Primer Premier 5.0 软件设计3′和5′特异扩增引物rCA-F3和rCA-R3，由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)，进行CA基因cDNA末端快速扩增，PCR产物切胶回收、连接转化到pEASY-T1载体及DH5α感受态细胞中，培养12 h，挑选白色单菌落，将阳性克隆进行测序。

表1 实验所用引物及其序列

1.2.3CA基因的序列及进化分析

利用DNAMAN6.0软件进行拼接3′和5′-RACE片段序列，得到CA基因cDNA全长；使用ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测氨基酸序列以及理化性质；ORF Finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测CA基因的开放阅读框；Clustal X软件对氨基酸多序列进行比对；ExPASy软件推测蛋白质理化性质；SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质功能域；使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-sw)以及Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-sw)分别分析蛋白质跨膜区和信号肽区域；MEGA6.0软件构建系统进化树。

1.2.4CA基因在缢蛏不同组织以及盐度胁迫下的鳃mRNA表达

盐度胁迫实验设计5组：盐度5、15、20、25和35，以盐度20为正常盐度对照，每组12个缢蛏，重复实验2次。取盐度20的鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、中间膜、肾脏、水管和足用于组织表达分析，实验胁迫后4、8、12、24、48、72和96 h取各个实验组的鳃用于CA基因表达分析，将样品置于液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。Trizol提取总RNA，使用TaKaRa Prime Script RT reagent Kit反转录成cDNA，产物于-20 ℃冰箱中保存备用。引物设计参照缢蛏CA基因转录组文库EST片段，用Primer Premier 5.0软件设计引物qCA-F4和qCA-R4，使用2×TaqMaster mix试剂以及Light Cycler 480Ⅱ仪进行荧光定量PCR反应，结果采用2-ΔΔCt法进行比较分析。

1.3 数据处理与分析

实验数据利用SPSS Statistics 17.0软件分析，单因素方差分析进行显著性检验，多重比较检测各测量指标的差异，以P< 0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 盐度变化对缢蛏血液离子浓度的影响

随着盐度的增加，血液Na+浓度均呈上升状态，低盐度组中，血液Na+浓度均呈现下降趋势，最终趋于平稳；高盐度组中，血液Na+浓度均呈现上升趋势，最终趋于平稳。在96 h时，各个实验组与对照组相比，低盐组浓度分别降低了70.0%和32.1%，高盐组浓度分别增加了27.3%和115.0%，见图1。

图1 不同盐度对缢蛏血液Na+离子含量的影响

随着盐度的增加，血液K+浓度均呈上升状态，低盐度组中，血液K+浓度均呈下降趋势，最终趋于平稳；高盐度组中，血液K+浓度均呈上升趋势，最终趋于平稳。在96 h时，各个实验组与对照组相比，低盐组浓度分别降低了70.8%和39.8%，高盐组浓度分别增加了45.9 %和84.4%，见图2。

图2 不同盐度对缢蛏血液K+离子含量的影响

随着盐度的增加，血液Cl-浓度均呈上升状态，低盐度组，血液Cl-浓度均呈现下降趋势，最终趋于平稳；高盐度组，血液Cl-浓度均呈上升趋势，最终趋于平稳。在96 h时，各个实验组与对照组相比，低盐组浓度分别降低了54.9%和18.2%，高盐组浓度分别增加了19.7%和53.8%，见图3。

图3 不同盐度对缢蛏血液Cl-离子含量的影响

阴影代表poly A；加框代表CA基因的起始密码子和终止子；单下划线部分代表Carb_anhydrase(18-258aa)；双划线部分代表Carb_anhydrase(268-539aa)功能区；*代表蛋白翻译结束

2.2 CA基因的克隆

CA基因cDNA全长2 182 bp，开放阅读框(ORF)长度1 788 bp，3′非编码区(UTR)长度为117 bp，含22 bp的polyA尾，包含终止密码子TGA，5′非编码区(UTR)长度为277 bp。ExPASy软件推导出ORF编码575个氨基酸，包含66个碱性氨基酸(R, K, H)、74个酸性氨基酸(D, E)、217个疏水性氨基酸(A, V, L, P, I, F, W, M)、218个亲水性氨基酸(G, S, T, C, Y, N, Q)，该蛋白质含有很大比例的亲水性氨基酸，表现为亲水性，该蛋白质的分子质量为64.94 ku，等电点pI=5.09；TMHMM软件和SignalP软件预测该蛋白质无跨膜区，但有信号肽(1-15)。Smart软件进行功能域预测显示，CA存在2个保守结构域：Carb_anhydrase(18-258aa)—Carb_anhydrase(268-539aa)。

使用MEGA6.0软件，对缢蛏和其他10个物种的氨基酸序列进行了序列比对和系统进化树分析。结果显示：CA基因与太平洋牡蛎(Crassostreagigas，EKC20938.1)，虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis，OWF36341.1)，美洲牡蛎(Crassostreavirginica，XP_022312365.1)双壳贝类同源性较高；与小鼠(Musmusculus，AAA50291.1)，原鸡(Gallusgallus，CAA78681.1)，中华鳖(Pelodiscussinensis，XP_014437230.1)，斑马鱼(Daniorerio，NP_571185.1)，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus，XP_003456776.1)，南美白对虾(Penaeusvannamei，ADM87521.1)，中国对虾(P.chinensis，ASU87567.1)等动物的同源性较低。进化树分析表明：缢蛏与软体动物、甲壳类的亲缘性较近，与鸟类、哺乳类、鱼类、两栖类等脊椎动物的亲缘性较远，见图5。

图5 采用MEGA 6.0软件NJ法构建的进化树

2.3 CA基因在缢蛏不同组织以及盐度胁迫下鳃mRNA表达

CA基因在不同组织中的mRNA表达量结果显示，CA基因在缢蛏成体的足、水管、肝胰腺、外套膜、鳃、肾、唇瓣、中间膜中均有表达，该基因在缢蛏鳃中表达量相对其他7个组织最高(P<0.05)，其次是肝胰腺，在足组织中的表达量最低，见图6。

图6 CA基因在缢蛏不同组织中的表达分析

CA基因在缢蛏不同浓度盐度胁迫下的mRNA表达量结果显示：在高盐和低盐环境适应过程中，CA基因在鳃中的表达量持续上升，在24 h达到峰值，显著高于盐度20的对照组(P<0.05)，随后表达量显著下降并逐渐趋于平稳。在盐度5与盐度35的实验组中CAmRNA 表达水平比盐度15与盐度25实验组的变化趋势更加明显，见图7。

图7 在不同盐度下鳃中CA基因不同时间的表达水平

3 讨论与结论

离子浓度是海洋生物渗透调节研究的重要评价指标，海洋生物可以通过离子调节适应水环境的变化，当环境胁迫压力超出自身调节的能力则会引起死亡[21-23]。在高渗环境中，缢蛏血液渗透压低于水体渗透压，机体被动失水，为补偿失水，缢蛏开始大量吸收海水并摄入大量NaCl，血清中Na+和Cl-离子迅速升高；在低渗环境中则反之[24-25]。随着对水环境的适应，缢蛏进入主动调节阶段，体内相应的离子转运酶活力提高，调节离子浓度至逐渐平稳。由此可见，缢蛏具有一定的渗透压平衡调节能力，能适应一定范围内的盐度变化。研究发现：与对照组相比，缢蛏血液渗透压随盐度降低而下降至逐渐平稳；随盐度升高而升高至逐渐平稳。在本实验中，Na+、K+和Cl-离子与血液渗透压变化呈正相关关系，变化趋势与渗透压变化趋势一致，低盐度组，Na+、K+和Cl-浓度随盐度降低而下降直至最后平稳；高盐度组，Na+、K+、Cl-浓度随盐度升高而上升直至最后平稳，这与日本鳗鲡(Anguillajaponica)、点篮子鱼(Siganusguttatas)和尼罗罗非鱼盐度胁迫的研究结果基本一致[26-27]。

本实验通过测定缢蛏不同盐度胁迫时间的血清离子浓度、CA基因克隆及CA基因表达量的测定，研究了血液离子在盐度胁迫下的变化和CA基因的序列特征及其在盐度适应过程中的变化，为血液离子、CA基因在渗透压调节中的作用机理研究奠定了理论基础。实验结果表明：缢蛏能适应一定的低盐与高盐的海水环境，在适应环境过程中，可通过鳃来调节血液渗透压和离子浓度。在急性盐度胁迫下，缢蛏鳃CA基因mRNA表达量变化，表明了CA在盐度变化后发挥了作用。