猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

李 艳，楚品品，雷 雯，勾红潮，蒋智勇，蔡汝健，宋 帅，卞志标，杨东霞，李春玲

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广州510640；2.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广州510640；3.农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；4.广东省妇幼保健院，广州510010）

猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要导致多种家畜及野生动物出现发热、奇痒、神经系统症状和脑脊髓炎等症状[1]。猪是其自然宿主和贮存宿主。2011年下半年以来，在中国多数地区猪场出现猪伪狂犬病病毒变异毒株，引起母猪的流产风暴及仔猪高死亡率，造成严重经济损失[2-3]。精准有效的病毒检测方法对于猪伪狂犬病的防控具有重要意义。gE基因是PRV的主要毒力基因之一，目前世界各国广泛使用的PRV基因缺失疫苗多为gE基因缺失苗，gE基因可用于区分PRV野毒和疫苗毒[4]。

LNA（locked nucleic acid）-TaqMan探针是一种应用于实时荧光PCR的新型探针，其在TaqMan探针的基础上选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，大大提高了探针与目标序列的亲和力，提高了探针的Tm值，同时探针信号增强，信噪比增大，极大缩短了探针长度，使检测灵敏度更高[5-6]。目前LNA-TaqMan探针已在病原[7-8]、基因突变[9-10]及鉴别诊断[11-12]检测等方面得到广泛应用。最新研究显示，该技术已成功应用于近期肆虐的非洲猪瘟病毒的检测[13]。目前尚未见有应用LNA-TaqMan探针检测PRV的荧光定量PCR方法的研究报道。

本研究根据gE基因保守区序列，设计合成了特异性的引物和探针，建立了可用于诊断猪伪狂犬病病毒野株的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法，并与同时建立的普通TaqMan探针荧光定量PCR方法进行了比较，为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了一种技术选择。

1 材料与方法

1.1 供试病毒株 PRV野毒株及Bartha-K61疫苗毒、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory sydrome virus，PRRSV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）均由广东省畜禽疫病防治研究重点实验室保存。

1.2 主要试剂和主要仪器 克隆载体pMD18-T、ExTaq以及Premix ExTaq（Probe qPCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物和探针 选取PRV基因组上的gE基因设计引物（P1、P2）和探针，用作LNA-TaqMan和常规TaqMan探针实时荧光定量PCR的引物和探针，序列见表1。

表1 本研究使用的引物和探针信息Table 1 Primers and probes used in this study

1.4 病毒DNA的提取 根据DNAzol说明书从PRV的细胞培养物或组织中提取总DNA，用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度及纯度，-20℃保存备用。

1.5 PCR反应体系和反应条件 实时荧光定量PCR反应体系（20 μL）为：2×Premix ExTaq10 μL，PRV-P1/P2各1 μL，探针0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 6.5 μL。扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40个循环。

1.6 标准质粒样品的制备 以PRV阳性材料提取的DNA为模板，扩增包含目的片段的DNA序列，产物经回收纯化后插入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取pMD18T-PRV重组质粒，经PCR及酶切鉴定。阳性质粒用紫外分光光度计测浓度和纯度，OD260定量浓度，并转换成拷贝数。拷贝数=浓度×阿伏伽德罗常数/（1个碱基对的平均分子质量×总长度），阿伏伽德罗常数为6.02×1023。已知拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释作为标准品，-20℃保存备用。

1.7 标准曲线的绘制 将质粒标准品稀释为1×107copies/μL后10倍梯度稀释至1×101copies/μL，并以此作为模板进行荧光定量PCR得出各自的荧光扩增曲线，生成标准曲线。

1.8 特异性试验 分别提取PRV野毒及疫苗毒、CSFV、PRRSV、PPV和PCV2核酸，利用建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法进行扩增，验证所建立检测方法的特异性。

1.9 敏感性试验 取已知PRV重组质粒阳性样品，测定其浓度，将其10倍梯度稀释为1×107～1×101copies/μL共7个系列的标准品，以此为模板进行TaqMan探针和LNA-TaqMan探针荧光定量PCR检测。比较两者所能检测出的最低拷贝数以评估这两种检测方法的敏感性。

1.10 批间及批内重复性试验 LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法在同一批次不同批次样品之间重复检测3株不同病毒样品，包括WH（KT948051）株、QY（KT948053）株及SH（KT948054）株，每次试验设6次重复，共进行3次试验，记录Ct值，计算批内和批间的变异系数。

1.11 样品的检测 对广东及周边省份发病猪场送检的疑似伪狂犬病病料共67份进行处理，提取DNA，分别用TaqMan探针荧光定量PCR、LNA-TaqMan探针荧光定量PCR及病毒分离培养方法进行检测，并对检测结果进行比较。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR标准曲线的绘制 将PRV阳性重组质粒标准品10倍梯度稀释为1×107～1×101copies/μL共7个梯度，分别进行TaqMan探针荧光定量PCR和LNA-TaqMan探针荧光定量PCR，获得了PRV标准品TaqMan探针法和LNA-TaqMan探针法标准扩增曲线（图1），LNA-TaqMan探针法检测PRV阳性重组质粒DNA标准曲线的浓度在1×101～1×107copies/μL范围内具有很好的相关性，线性方程y=-3.3296x+39.521，R2=0.9982，而TaqMan探针法检测PRV阳性重组质粒DNA标准曲线的浓度在1×102～1×107copies/μL范围内具有很好的相关性，线性方程y=-3.4231x+42.832，R2=0.9958，见图2。

图1 LNA探针和TaqMan探针实时荧光定量PCR测定标准质粒扩增曲线Fig.1 The dynamic curve for the LNA-TaqMan real-time PCR and the TaqMan real-time PCR

图2 LNA探针和TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线Fig.2 The standard curve for the LNA-TaqMan real-time PCR and TaqMan real-time PCR

2.2 灵敏度检测 结果显示，LNA-TaqMan探针法最低检测的PRV阳性重组质粒DNA浓度为1 copies/μL，但这一浓度下不能呈现稳定的阳性结果，仅有5（5/20）份样品显示阳性结果，而在浓度为101copies/μL时，阳性检出率为100%，而TaqMan探针在PRV DNA浓度为102copies/μL时阳性检出率为100%。因此，LNA-TaqMan探针法最低检测限为101copies/μL，而TaqMan探针法为102copies/μL（表2）。

表2 LNA 探针和TaqMan探针对不同浓度质粒阳性检出次数Table 2 Numbers of positive detection with LNA probe and TaqMan probe at different plasmid concentrations

2.3 特异性检出结果 采用本研究建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR法对PRV野毒及疫苗毒、CSFV、PRRSV、PPV和PCV2进行检测结果只有PRV野毒能被扩增到，扩增曲线呈现明显的“S”形，其余病毒均无扩增条带，表明建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有良好的特异性。

2.4 重复性试验结果 在同一批次和不同批次样品之间重复检测不同浓度的3株PRV野毒株样品（WH株、QY株、SH株），每次试验设6次重复，共进行3次试验，记录Ct值，结果表明该方法的重复性较好，批内变异系数为0.43%～0.64%，批间变异系数为0.44%～2.34%（表3）。

表3 LNA-TaqMan荧光定量PCR的批内和批间变异系数Table 3 The inter- and intra- assay for LNA-TaqMan real-time PCR

2.5 临床样本检测 应用常规TaqMan探针和LNATaqMan探针荧光定量PCR法，对67份疑似临床样品进行检测。结果显示：LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检出的PRV阳性样品为26份；常规TaqMan探针荧光定量PCR方法检出的PRV阳性样品为21份。用病毒分离方法从23份样品中分离出PRV。LNATaqMan探针荧光定量PCR法与病毒分离培养法的符合率为96%，具体检测结果见表4。

表4 LNA-TaqMan探针和TaqMan探针荧光定量PCR方法检测结果Table 4 The results of the clinic samples tested by LNATaqMan real-time PCR and TaqMan real-time PCR

3 讨论

猪伪狂犬病是危害养猪业健康发展的重要传染病之一。快速、准确的诊断方法的建立，对于猪伪狂犬病防控至关重要。练斯南等[14]针对gE和gB基因，建立了鉴别诊断猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法，其特异性较好，但敏感性较低。陈如敬等[15]针对猪伪狂犬病病毒gE基因，建立了PRV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，该方法的检测最低极限为7.53×101copies /μL，检测灵敏度仍有待提高。侯月娥等[16]建立了可以区别野毒株和基因缺失疫苗株的TaqMan荧光定量PCR方法，并对其全预混PCR试剂进行了冻干工艺优化。国外研究者针对猪伪狂犬病病毒gB基因开发了一种单管实时荧光定量PCR快速检测方法[17]。

LNA是核苷酸化学修饰新技术，是一种新型类寡核苷酸衍生物，其碳环的2'-O位和4'-C位通过缩水作用形成亚甲基桥并连接成锁状结构，该结构降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架的稳定性，PCR反应中其与DNA、RNA结合成双链的稳定性和亲和力更高[18-19]。在普通探针中每插入一个LNA碱基，其退火温度可提高3～8℃，使TaqMan探针的信号增强、信噪比提高[20]。解链温度相同时，LNATaqMan探针与常规TaqMan探针相比更短，扩增干扰更少，PCR效率更高[21]，因此LNA-TaqMan探针比常规TaqMan探针更敏感。Josefsen等[22]在实时荧光定量PCR检测中，LNA探针是4种不同探针（MGB探针、TaqMan探针、Scorpion探针、LNA探针）中敏感性最强的探针。此外，基于这一特点LNA-TaqMan探针已被应用于检测复杂的目标序列，如AT或GC富含区。PRV基因组GC含量较高，很容易造成扩增的非特异性，给临床检测带来很多不确定性。本研究将新型类寡核苷酸衍生物LNA引入探针序列中，结合实时荧光定量PCR方法建立了猪伪狂犬病病毒野毒的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，并与同时建立的相对应的常规TaqMan探针法进行比对。结果显示，建立的LNA-TaqMan探针法的敏感性优于常规TaqMan探针法，扩增敏感性高于普通TaqMan探针法10倍，最低检测限为101copies/μL；重复性较好，LNA探针法批内和批间试验的变异系数分别为0.43%～0.51%、0.44%～2.34%。

本研究建立的检测猪伪狂犬病病毒野毒的LNATaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度更高、稳定性更好、信噪比更低的优点，为临床PRV检测提供了技术参考。