塞来昔布对膀胱癌细胞移植小鼠的治疗作用及机制

梁 冰，罗后宙

(海南省第三人民医院(三亚中心医院)泌尿外科，海南 三亚 572000)

膀胱癌是人体常见肿瘤之一，占中国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童，其发病率随年龄增长而逐渐增加[1-3]。塞来昔布(celecoxib)是一种特异性的Cox-2抑制剂，可调控细胞周期，促进癌细胞凋亡，抑制血管生成[4]。研究发现，塞来昔布可以抑制乳腺癌细胞的能动性和侵袭性，加速乳腺癌MCF-7细胞凋亡[5]。此外，塞来昔布对药物诱导的膀胱癌小鼠模型具有一定的治疗作用[6-7]。但其治疗机制的研究报道较少，因此，本研究观察塞来昔布对膀胱癌小鼠的治疗情况并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SPF级BALB/c雄性裸鼠60只，体质量15～18 g，周龄3～4周[中国医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK(辽)2013-0007]。塞来昔布(Pfizer Pharmaceuticals LLC，国药准字J20120063)，人膀胱癌细胞系5637(南京海克尔生物科技有限公司)，人膀胱移行上皮细胞(上海联迈生物工程有限公司)，PMI-1640高糖培养基、二氨基联苯胺(DAB)、细胞总蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒及Western blot检测相关试剂(上海索莱宝生物科技有限公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗鼠一抗(CD4+、CD8+、COX-2、VEGF及cPLA2)、羊抗兔二抗[赛默飞(上海)世尔科技有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 造模： 将60只小鼠随机分为对照组、模型组及观察组，每组各20只。取人膀胱癌细胞系5637细胞培养至良好状态；取模型组及观察组小鼠，在超净台中于小鼠臀部皮下注射生长良好的细胞，每只注射2×106个重悬于100 μL PBS中的人膀胱癌细胞系5637细胞；对照组注射人膀胱移行上皮细胞，注意针头在皮下潜行约0.5 cm，拔出针头后用棉签轻压穿刺点以防止细胞液溢出。

1.2.2 给药方法： 配制塞来昔布溶液：将塞来昔布(200 mg/粒)溶于灭菌注射用水中，剂量为100 mg/kg。第9周开始，观察组小鼠给予塞来昔布灌胃治疗：20 mL/kg，1次/d。对照组及模型组小鼠给予0.9%氯化钠溶液灌胃治疗：20 mL/kg，1次/d。3组小鼠均连续灌胃给药4周。本次实验过程中，未出现小鼠因灌胃操作意外死亡。

1.2.3 测量各组小鼠瘤体质量，并计算肿瘤抑制率： 末次给药后，颈椎脱臼处死小鼠剥离完整肿瘤组织，0.9%氯化钠溶液漂洗，吸水纸吸干水分后称重，记录肿瘤质量并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(模型组瘤质量-观察组瘤质量)/模型组瘤质量×100%。

1.2.4 免疫细胞浸润检测： 用药结束1周后，颈椎脱臼处死小鼠，取模型组和实验组小鼠瘤组织及对照组正常组织，利用4%多聚甲醛固定组织样本，脱水，石蜡包埋，切片，烘干备用。采用免疫组化检测3组小鼠组织中CD4+、CD8+表达量，并计算CD4+/CD8+比值。取3组小鼠组织切片，脱蜡、水化，PBS冲洗2次，5 min/次，切片浸入0.01 moL/L柠檬酸缓冲液，加热至沸腾后断电，间隔10 min后再次加热至沸腾。冷却后PBS冲洗2次，5min/次。加入5% BSA封闭液，20 min后滴加CD4+、CD8+一抗，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗6次，5 min/次，加入适当浓度(1∶5 000)的羊抗兔二抗，室温孵育1 h。PBS漂洗3次，5 min/次。滴加SABC试剂20 min，PBS漂洗4次，5 min/次，DAB显色，蒸馏水洗，HE染色，脱水、透明、封片、镜检。利用SABC法检测CD4+、CD8+细胞阳性表达量。

1.2.5 蛋白检测： 采用Western blot法检测环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)及胞质型磷脂酶A2(cPLA2)蛋白。取模型组和实验组小鼠瘤组织及对照组正常组织，匀浆，提取总蛋白。BCA法测定总蛋白，采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行分离纯化，转至PADF膜。利用TBS将膜润湿，室温封闭1 h后加入1∶1 000稀释的COX-2、VEGF及cPLA2蛋白一抗及β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，Tris-HCl 缓冲液漂洗6次，5 min/次，加入适当浓度(1∶5 000)的羊抗兔二抗，室温孵育1 h。TBST漂洗4次，5min/次。以β-actin为内参，对目的条带行半定量分析。

1.2.6 细胞凋亡率检测： 取模型组及观察组小鼠组织切片，脱蜡、水化，PBS冲洗2次，5 min/次，滴加50 μL TUNEL反应混合液，37 ℃避光密封反应60 min，滴加50 μL converter-POD，37 ℃避光密封反应30 min，PBS漂洗3次，5 min/次，HE染色，脱水、透明、封片。利用光学显微镜，观察细胞凋亡情况。凋亡指数=阳性细胞数/1500×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠成瘤情况

实验过程中无小鼠死亡。对照组小鼠正常生长，皮下无肿瘤生成。模型组和观察组接种部位皮下均出现肿瘤，成瘤率100%。模型组和观察组小鼠的瘤体质量分别为(2.08±0.36)g和(1.18±0.21)g，与模型组相比，观察组小鼠瘤体质量显著降低(P<0.05)。观察组小鼠的肿瘤抑制率为43.33%。

2.2 免疫细胞浸润检测

模型组及观察组小鼠瘤组织中CD4+、CD4+/CD8+均显著低于对照组小鼠(P<0.05)；模型组及观察组小鼠瘤组织中CD8+均显著高于对照组小鼠(P<0.05)。且观察组小鼠瘤组织中CD4+、CD4+/CD8+水平明显高于模型组小鼠，CD8+水平明显低于模型组小鼠(表1)。

表1 3组小鼠免疫细胞浸润比较

2.3 蛋白表达检测

COX-2及cPLA2蛋白在对照组小鼠正常组织中不表达，在模型组及观察组小鼠瘤组织中均呈现不同程度阳性表达，且观察组小鼠中上述蛋白阳性表达水平明显低于模型组小鼠(P<0.05)。VEGF蛋白在3组小鼠组织中均有阳性表达，其中观察组小鼠中VEGF蛋白表达水平明显高于对照组小鼠，而低于模型组小鼠(P<0.05)(图1)。

2.4 细胞凋亡检测

观察组小鼠移植瘤细胞凋亡指数为18.50%±2.05%，模型组小鼠移植瘤细胞凋亡指数为4.25%±0.50%，观察组小鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于模型组小鼠(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group图1 各组小鼠COX-2、cPLA2及VEGF蛋白表达水平Fig 1 Expression of COX-2, cPLA2 and VEGF in mice of each

图2 模型组和观察组小鼠移植瘤细胞凋亡情况比较Fig 2 Apoptosis of implanted tumour in model group and observation group

3 讨论

膀胱癌具有病情进展快、病死率及复发率高、患者预后差等特点。近年来，中国膀胱癌的发病率及病死率均呈现逐年上升的趋势[8]。慢性炎性反应是膀胱癌发展的重要危险因素。与炎性反炎相关的癌症风险涉及许多因素，包括感染(细菌、细菌性血球菌、病毒)、免疫系统疾病以及慢性化学和机械刺激[9]。淋巴细胞可通过参与炎性反应晚期过程，发挥细胞免疫功能，是淋巴系统免疫功能的主要执行者。塞来昔布是一种新一代化合物，具有独特的作用机制，可特异性地抑制COX-2。研究发现，塞来昔布治疗肝癌模型小鼠，可降低其外周血及肿瘤浸润淋巴细胞中Treg的比例[10]。本次研究利用注射人膀胱癌细胞系5637细胞制备膀胱癌小鼠模型，初步观察了塞来昔布对膀胱癌细胞小鼠移植瘤组织中免疫细胞表达情况的影响。结果显示，模型组及观察组小鼠瘤组织中CD4+、CD4+/CD8+水平均显著低于对照组小鼠，CD8+水平均显著高于对照组小鼠，提示膀胱癌可导致小鼠组织内细胞免疫失衡。此外，观察组小鼠瘤组织中CD4+、CD4+/CD8+水平明显高于模型组小鼠，CD8+水平明显低于模型组小鼠，提示塞来昔布灌胃膀胱癌小鼠可明显改善免疫细胞表达水平，提高小鼠局部免疫功能，激活免疫系统的反应性。

膀胱癌肿瘤的生长及转移是导致患者死亡的主要原因之一。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，可促进肿瘤新生血管生成、生长及转移[11]。COX-2及cPLA2均为参与调节前列腺素生成的蛋白，控制其表达水平是防治膀胱癌的有效途径[12]。本次研究结果显示，COX-2及cPLA2蛋白在对照组小鼠膀胱组织中不表达，VEGF在3组小鼠膀胱组织中均呈现不同程度阳性表达。其中观察组中COX-2、VEGF、cPLA2蛋白表达水平明显高于对照组而低于模型组，提示塞来昔布可降低上述炎性反应相关蛋白在膀胱癌组织中的表达。炎性因子的刺激可加速诱导COX-2生成，进而导致炎性前列腺素类物质的合成及聚积，尤其是前列腺素E2，引起炎性反应、水肿及疼痛。塞来昔布为特异性COX-2抑制剂，可通过抑制COX-2、新生血管及前列腺素的生成，减轻炎性反应。

凋亡细胞指数是衡量肿瘤组织中细胞凋亡程度的重要指标。本研究TUNEL实验结果显示，观察组小鼠癌细胞凋亡指数明显高于模型组小鼠，说明塞来昔布可在一定程度上促进膀胱癌小鼠细胞凋亡，抑制其增殖。

综上所述，塞来昔布对膀胱癌小鼠具有一定的抑制作用，可调节膀胱癌小鼠组织细胞中免疫蛋白及癌症相关蛋白的表达水平，此外还可促进膀胱癌细胞凋亡。