5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A1细胞增殖及SFRP1、MGMT甲基化蛋白表达的影响

华丛书，叶 静，陈 海，葛腾飞，陈晓宇

(1.安徽医科大学胸科临床医院，安徽省胸科医院胸外科，安徽 合肥 230022 ；2.安徽医科大学第二附属医院呼吸内科，安徽 合肥 230601；3.安徽医科大学形态实验中心，安徽 合肥 230032)

肺癌为常见的原发性肺部恶性肿瘤，其发病机制未明。在肺癌发生发展中，Wnt信号通路为保守的信号通路，通过细胞外因子与细胞膜跨膜受体结合，再由胞质连锁蛋白(β-catenin) 结合，进入细胞核内后，与核内转录因子等共同作用，激活靶基因[1]。从细胞生物学水平揭示肺癌的基因表达调控，可提高肺癌早期诊疗水平[2]。研究表明[3]，在肺腺癌发病中，负调控因子分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled related protein 1，SFRP1)基因启动子区5′端CpG岛的甲基化是导致Wnt信号通路沉默的重要原因。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)为DNA修复酶，可移除鸟嘌呤O6-甲基的烷化基团，还原鸟嘌呤，防止细胞被烷化剂损伤而恶变[4]。DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)具有与嘧啶类似的结构，可共价结合DNA甲基转移酶，抑制其酶活性，恢复甲基化的CPG岛的抑癌功能[5]。故SFRP1、MGMT基因去甲基化可能在肺癌发病中有一定作用，有望成为潜在的肺癌个体化治疗靶点[6]。目前，5-Aza-CdR对肺癌SPC-A1细胞甲基化基因、蛋白和机制影响未明，本研究拟体外观察5-Aza-CdR对肺癌SPC-A1细胞增殖、细胞迁移和凋亡的影响，探讨SFRP1和MGMT甲基化改变，旨在为临床早期诊疗肺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人肺癌细胞株SPC-A1购于中国医学科学院上海肿瘤细胞库，本研究室保存并传代培养。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(批号2352-33-5，上海物竞化工)；兔抗人SFRPl多克隆抗体(货号 ABP55900，英国 Abcam公司)，兔抗人MGMT多克隆抗体(货号 LS-C205541，美国LSBio)，兔抗人GAPDH多克隆抗体(货号 SY0636，北京百奥莱博)；DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco生物技术公司)；甲基化特异性PCR试剂盒、TRIzol试剂盒、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(美国Introgen公司)； PCR引物由上海生工生物有限公司合成。BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)；羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥生物技术公司)；青链霉素溶液、CCK-8试剂盒、ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物试剂公司)，其他试剂为国产分析纯。倒置荧光显微镜(Ti2型，日本Nikon公司)；酶标仪(IMARK型，美国BIO-RAD公司)；凝胶成像分析系统(Chemi Doc型，美国BIO-RAD公司)。

1.2 人肺癌细胞株SPC-A1细胞培养和细胞增殖实验

1.2.1SPC-A1细胞培养 SPC-A1细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基(内含1%青、链霉素双抗)，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中，每2 d更换液1次，至SPC-A1细胞70%-80%融合时，胰酶消化传代。

1.2.2CCK-8法检测不同浓度5-Aza-CdR对SPC-A1细胞增殖的影响 96孔培养板中，每孔加入100 μL的1.0×105个SPC-A1细胞，细胞贴壁后，加药处理，设不同浓度的5-Aza-CdR处理(0.5、1、3、5、10、30、60、100、200 μmol·L-1)，以不含5-Aza-CdR(0 μmol·L-1)细胞培养液作为对照组，每孔细胞设5个复孔。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，培养箱中继续作用4 h。酶标仪(芬兰雷勃公司)检测450 nm处测定吸光度(Absorbance，A)值。计算5-Aza-CdR对细胞SPC-A1细胞生长抑制率：细胞生长抑制率/%=(1-给药组A值/对照组A值)×100%。实验重复3遍。

1.3 划痕实验测定5-Aza-CdR对SPC-A1细胞迁移能力的影响将浓度为1.0×107·L-1的SPC-A1接种于6孔培养板培养24 h，弃去培养基，沿6孔板中轴线，使用微量吸管枪头在贴壁肺癌SPC-A1细胞表面划痕，PBS漂洗5 min×3次，去除细胞残渣，加入含5-Aza-CdR(终浓度0、3、10、30 μmol·L-1)的DMEM培养基，再在CO2培养箱中常规培养48 h，拍照，计算5-Aza-CdR对SPC-A1抑制细胞划痕愈合率，细胞划痕愈合率/%=(初始划痕宽度-48 h划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。

1.4 Hoechst 33258荧光染色检测5-Aza-CdR处理后SPC-A1细胞细胞凋亡情况对数生长期的肺癌SPC-A1细胞，1 × 107个·L-1细胞接种于6孔板中，预先在6孔板中放入涂有多聚赖氨酸的盖玻片。37 ℃、5%CO2培养箱中孵育 24 h，并加入5-Aza-CdR(终浓度为 0、3、10、30 μmol·L-1)，继续培养 48 h 后，取出盖玻片，丙酮固定10 min，PBS漂洗10 min ×3次；1% Triton X-100透化10 min，加入5 mg·L-1的Hoechst 33258染液，避光染色10 min，PBS 漂洗10 min×3次，封片，Nikon倒置荧光显微镜观察。

1.5 5-Aza-CdR处理SPC-A1细胞中SFRP1、MGMT mRNA表达SPC-A1细胞按每孔2×105个的密度接种于6孔板中，收集5-Aza-CdR(0、3、10、30 μmol·L-1)处理24 h的细胞，加入TRIzol裂解细胞后收取细胞悬液于1.5 mL EP管中，充分裂解；加入氯仿混匀，4 ℃离心15 min，取上清加异丙醇混匀，4 ℃离心10 min，沉渣加75%乙醇洗涤、离心；加入10 μL DEPC水，冰上溶解，分光光度计检测RNA浓度和纯度。按逆QPS-201转录试剂盒说明书反转录，Real-time PCR检测SPC-A1细胞中SFRP1mRNA、MGMT mRNA表达量，以GAPDH mRNA为内参，引物序列如下：SFRP1引物，F 5′-CGA GTTTGCACTGAGGATGA-3′，R 5′-CAGCACAAGCTT CTTCAGGTC-3′； MGMT引物，F 5′-AGTAGGAGGA GCGATGAGGAG-3′，R 5′-AGAAGCCACTCTCTTTCAC ATCT-3′； GAPDH引物，F 5′-AGGTGAAGGTCGGA GTCAACG-3′，R 5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′。PCR反应体系为10 μL、上游、下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。根据2-△△Ct法计算各组相对SFRP1 mRNA、MGMT mRNA相对含量。

1.6 5-Aza-CdR处理SPC-A1细胞中SFRP1、MGMT蛋白表达1 × 107个·L-1对数生长期的SPC-A1细胞接种于6孔板，CO2培养箱中常规培养24 h，加入不同浓度(0、3、10、30 μmol·L-1)的5-Aza-CdR处理24 h，收集细胞，RIPA 裂解液提取总蛋白质，BCA试剂盒定量。30 μg蛋白质上样，SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白分离、转膜，兔抗人SFRP1多克隆抗体(1 ∶2 000)、MGMT多克隆抗体(1 ∶1 500)、内参GAPDH(1 ∶2 500)，4 ℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，ECL曝光、定影、显影。采用ImageJ 软件分析SFRP1/GAPDH、MGMT/GAPDH相对蛋白定量分析，实验重复3次，计算平均光密度值。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对SPC-A1细胞增殖的影响5-Aza-CdR作用SPC-A1细胞48 h后，CCK-8法检测SPC-A1细胞增殖情况，结果如Fig 1所示，与对照组(5-Aza-CdR 0 μmol·L-1)相比，5-Aza-CdR抑制SPC-A1细胞的增殖呈浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)，其IC50值为21.2 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of different concentrations of 5-Aza-CdR on proliferation of SPC-A1 cells

2.2 不同浓度5-Aza-CdR对细胞划痕实验的影响划痕实验结果如Fig 2所示，5-Aza-CdR作用48 h后，不同浓度的5-Aza-CdR可抑制肺癌细胞的迁移能力，以对照组(0 μmol·L-1的5-Aza-CdR)为100%计算，浓度为3、10、30 μmol·L-1的5-Aza-CdR对肺癌细胞划痕愈合分别为(89.4±2.6)%、(73.6±4.2)%、(56.7±4.5)%。

Fig 2 Cell scratch experiments at different concentrations of 5-Aza-CdR for 48 h(×10)

2.3 Hoechst 33258 荧光染色检测5-Aza-CdR对SPC-A1细胞凋亡情况不同浓度的5-Aza-CdR处理肺癌SPC-A1细胞 48 h后，在荧光显微镜下，经紫外光激发，可见5-Aza-CdR(3、10、30 μmol·L-1)出现典型的肺癌SPC-A1细胞凋亡形态学改变，表现为核染色质浓缩、碎裂。而未给5-Aza-CdR的对照组(0 μmol·L-1)细胞核呈较为均匀的蓝色荧光，见Fig 3。

Fig 3 Fluorescence staining results of Hoechst 33258 (×200)

2.4 RT-PCR法检测甲基化mRNA表达情况肺癌SPC-A1细胞RT-PCR检测发现，与无5-Aza-CdR 作用时相比较，随着5-Aza-CdR处理浓度的升高，SPC-A1细胞中SFRP1 mRNA、MGMT mRNA呈上升趋势，且随着5-Aza-CdR浓度(3、10、30 μmol ·L-1)的升高，SFRP1 mRNA、MGMT mRNA显著升高，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，见Fig 4。

Fig 4 Methylated mRNA expression in SPC-A1 cells after 5-Aza-CdR treatment detected by RT-PCR n=3)

2.5 Westernblot法检测甲基化蛋白表达情况肺癌SPC-A1细胞蛋白免疫印迹检测发现，无5-Aza-CdR 作用时，SPC-A1细胞中SFRP1、MGMT蛋白呈低表达状态；随着5-Aza-CdR处理浓度的升高，SPC-A1细胞中SFRP1、MGMT蛋白呈上升趋势，见Fig 5A。SFRP1/GAPDH、MGMT/GAPDH相对蛋白图像扫描半定量统计结果表明，且随着5-Aza-CdR浓度(3、10、30 μmol·L-1)的升高，SFRP1、MGMT蛋白表达较对照组升高，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，见Fig 5B。

Fig 5 Effect of methylated protein expression in SPC-A1 cells after 5-Aza-CdR treatment detected by Western blot

3 讨论

肿瘤细胞DNA 异常甲基化是一种常见的表观遗传学改变，在基因碱基序列没有改变的情况下，通过碱基序列增减甲基而使基因结构改变，影响癌基因和抑癌基因表达；同时，也为临床治疗肿瘤、改变肿瘤遗传特性提供一种新的方法[2]。5-Aza-CdR是核苷类甲基化调节物，可以特异性抑制DNA 甲基转移酶活性，下调细胞周期的S期基因甲基化水平，阻断细胞甲基化反应，从而抑制肿瘤的生长[7]。本研究通过CCK-8法，检测5-Aza-CdR对人肺癌SPC-A1细胞生长的影响，结果表明，5-Aza-CdR对肺癌细胞增殖呈抑制作用，且该作用与5-Aza-CdR浓度呈正相关。

抑制肿瘤细胞侵袭转移和促进肿瘤细胞凋亡是临床肿瘤化疗的基础，本研究通过5-Aza-CdR作用肺癌SPC-A1细胞24h后，肺癌细胞迁移能力下降，且随着5-Aza-CdR浓度的增加而增多，提示5-Aza-CdR抑制肺癌细胞增殖活力的机制可能与其抑制肺癌细胞侵袭转移有关。凋亡形态学改变早期表现为核染色质的结构改变，DNA特异性染料Hoechst 33258通过A-T键结合，荧光显微镜观察细胞核可诊断[8]。本研究观察到Hoechst 33258荧光染色在无5-Aza-CdR作用下，细胞核荧光染色均匀一致，应用5-Aza-CdR后，出现典型的细胞凋亡形态，细胞核染色质浓缩或碎裂，且随着5-Aza-CdR浓度升高，该现象更加明显，表明5-Aza-CdR可诱导肺癌SPC-A1细胞凋亡。

肺癌的发生发展进程中，启动子区DNA甲基化是导致基因失活的重要原因，通过降低基因组甲基化水平或上升基因启动子区域甲基化，引起基因功能缺失，引起肿瘤发生；若能通过去甲基化抑制剂逆转启动子区DNA甲基化异常状态，则有可能发挥起抑制肿瘤生长的功效[9]。本研究证实，甲基化抑制剂5-Aza-CdR对肺癌SPC-A1细胞增殖有抑制作用。在机制研究中，异常激活的Wnt/β-catenin 信号通路可引起细胞恶变，SFRPs 类是Wnt通路的抑制因子，SFRP1 是SFRPs 家族成员，SFRP1 基因甲基在DNA 甲基转移酶调控下，把甲基(供体为S-腺苷甲硫氨酸)转移到胞嘧啶的第5 位碳原子CpG岛上，形成5-甲基胞嘧啶，引起SFRP1 表达降低，导致肿瘤的进展和转移[10]。本课题组前期证实，与癌旁组织比较，NSCLC 组织中SFRP1 基因甲基化率显著升高，且与肿瘤的分化程度和淋巴结转移相关[11]。DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(MGMT)可移除鸟嘌呤O6-甲基的烷化基团，使鸟嘌呤还原，避免细胞被烷化剂损伤而产生恶变[4,12]。本实验采取不同浓度的5-Aza-CdR作用肺癌SPC-A1细胞株，观察作用前后SFRP1、MGMT表达，结果表明，在无5-Aza-CdR处理时，肺癌SPC-A1细胞中SFRP1、MGMT mRNA和蛋白呈低表达，5-Aza-CdR处理24 h后，去甲基化产物SFRP1、MGMT表达明显增多，且与5-Aza-CdR浓度相关。进一步证实5-Aza-CdR可激活并上调SFRP1、MGMT mRNA和蛋白表达，从而抑制肺癌SPC-A1细胞生长，具有抗肿瘤效应。

综上，本研究证实，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR可抑制肺癌SPC-A1细胞增殖，降低SPC-A1细胞侵袭转移，促进SPC-A1细胞凋亡，上调去甲基化产物SFRP1、MGMT mRNA和蛋白表达。本研究为将5-Aza-CdR应用于临床肺癌治疗提供一定的理论依据。