NO供体型大黄酸衍生物的合成及抗肿瘤活性

柏志伟，尚飞扬，戴卫国，何黎琴

（安徽中医药大学药学院,合肥230031）

大黄在我国具有悠久的药用历史，大黄酸（rhein，RH）是其有效活性成分之一。研究发现，大黄酸具有广泛的药理活性，尤其在抗炎、抗肿瘤等方面表现突出［1-3］。研究表明，大黄酸可用于多种肿瘤性疾病的治疗，具有广谱的抗肿瘤作用，且作用机制多样：大黄酸的蒽醌三环共平面结构可以嵌入到DNA 的碱基对中，与DNA 双螺旋结构可逆性的结合，从而导致DNA 裂解和影响DNA 的转录、合成，达到抗肿瘤的作用；能抑制大鼠肝细胞的能量代谢，影响肝细胞的呼吸链，造成肝细胞内过氧化物积累，最后造成肝细胞死亡；抑制人表皮生长因子的双靶点受体蛋白酪氨酸激酶的活性，达到抗乳腺癌的目的；能与细胞内的转录激活因子（AP-1）结合，通过AP-1 来调节结肠细胞对细胞毒剂的敏感性，达到抗肿瘤的作用；通过下调多药耐药相关蛋白1 的表达，逆转肿瘤细胞多药耐药性［4-8］。此外，大黄酸具有毒性低、安全性高等优势，为研发高效、低毒、多靶点的大黄酸类抗肿瘤药物提供了良好的先导化合物。由于大黄酸抗肿瘤活性不够强，溶解性能差，既不溶于水和醇，又不溶于绝大多数有机溶剂，生物利用度较低，使大黄酸的临床使用受到了很大限制。鉴于大黄酸的众多药理作用和明显的缺点，加之结构简单、可修饰位点较多，通过对其结构进行修饰和改造来改善大黄酸的溶解性能，增加其水溶性或脂溶性，提高其生物利用度和抗肿瘤活性，已成为当前的研究热点。多个课题组对其进行了结构修饰，取得了很好的效果，得到的系列大黄酸衍生物在抗肿瘤活性、溶解性能和生物利用度方面均具有较大的改善，为其进一步研发打下良好的基础［9-14］。

NO 作为重要的信使物质或效应分子，参与体内多种生理和病理反应。大量研究表明，体内高浓度的NO 可产生细胞毒性，诱导肿瘤细胞凋亡，阻止肿瘤细胞的扩散和转移，促进巨噬细胞杀死肿瘤细胞。研究发现，NO 供体型衍生物在药效或安全性方面较先导化合物有明显的改善［15-17］。受此启发，本课题组前期设计合成了系列NO 供体型苦参碱和香豆素的衍生物［18-21］，体外抗肿瘤活性强于母体化合物，部分化合物活性优于阳性对照药氟尿嘧啶。在此基础上，利用药物化学的拼合原理，本课题组通过大黄酸的2 位羧基与硝酸酯类NO供体偶联，设计合成了5个硝酸酯类NO供体型大黄酸衍生物，其抗肿瘤活性显著高于先导化合物大黄酸，部分化合物的抗细胞增殖作用强于氟尿嘧啶［22］。受此鼓舞，为获取更多的具有抗肿瘤活性的大黄酸衍生物，本研究拟选用另一类重要的NO 供体——呋咱氮氧化合物，通过不同的连接臂，将其与大黄酸-2-位羧基偶联，设计合成了7 个目标化合物。期望得到的化合物能改善大黄酸的溶解性，提高生物利用度，并能够在体内通过协同效应增强其抗肿瘤活性。

1 合成路线

以大黄酸（1）为原料，经二氯亚砜卤代得到大黄酰氯（2），中间体2 再与不同的羟烃氧基取代的呋咱（3a～3g）反应得到目标化合物（4a～4g）。合成路线见路线1。

Scheme 1 Synthetic routes of compounds 4a-4g

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LCQ ADVANTAGE MAX 液质联用质谱仪（美国Finnigan 公司）；Nicolet Acatar 370 DTGS 型红外光谱仪（美国Thermo Electron 公司）；AV 400 型核磁共振仪（德国Bruker 公司，溶剂为氘代二甲基亚砜）；薄层硅胶G板（100 mm×100 mm，合肥森瑞有限公司）；大黄酸（含量大于98%，西安小草植物科技有限责任公司；一氧化氮检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；血红蛋白（上海碧云天生物技术有限公司）。其他试剂均为市售分析纯。

2.2 化学合成

2.2.1 中间体（2）的合成 在干燥的100 mL圆底烧瓶中，加入大黄酸（1 g，3.5 mmol）和二氯亚砜（30 mL），DMF0.5 mL，70 ℃回流搅拌6 h，减压蒸去氯化亚砜，得橘红色固体1.1 g（不经纯化，直接用于下步反应）。

2.2.2 中间体3a～3g 的合成 参照文献［21］将苯硫酚（12.1 g，0.11 mol），氢氧化钠（4.4 g，0.11 mol）溶于95%乙醇50 mL 中，加入由氯乙酸（11.4 g，0.12 mol）和碳酸钠（6.35 g，0.06 mol）配成的水溶液100 mL，室温搅拌3 h，回流1 h。冷却至室温后加入6 mol/L 盐酸调至pH 2，减压蒸去乙醇，有白色沉淀生成，过滤，得白色棒状晶体2-苯硫基乙酸16.4 g，收率89%，mp：60.1～62.0 ℃。

将2-苯硫基乙酸（16.0 g，0.1 mol）溶于冰醋酸65 mL中，加入30%过氧化氢（20 mL，0.2 mol），室温搅拌2.5 h，得无色澄清溶液，滴加95%发烟硝酸（40 mL，0.9 mol）升温至90 ℃反应30 min，冷却至室温，有白色针状晶体3，4-二苯磺酰基-1，2，5-■二唑-2-氧化物析出，过滤干燥得14 g，两步收率76%，mp：154.2～156.0 ℃。

将相应的二醇（10 mmol）和3，4-二苯磺酰基-1，2，5-■二唑-2-氧化物（1 g，2.7 mmol）溶于THF 10 mL 中，滴入25%氢氧化钠溶液（0.5 mL，3 mmol），2 h 后，反应液从淡黄色变为橙黄色。将反应液倾入水20 mL中，用乙酸乙酯（20 mL×3）萃取，有机层合并后加饱和氯化钠溶液水洗一次，用无水硫酸钠干燥。过滤后将滤液浓缩，柱色谱［乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃），1∶4］，得白色粉末状固体3a～3g。

2.2.3 目标化合物4a～4g 的合成 将中间体3（1.0 mmol）、吡啶（0.24 mL，3.0 mmol）溶于二氯甲烷（DCM）20 mL 中，在冰盐浴中缓慢滴加大黄酸酰氯（453 mg，1.5 mmol）的二氯甲烷溶液，滴加完毕，升至室温搅拌，TLC检测反应进程。反应完毕，加水100 mL，DCM 萃取（20 mL × 3），有机相合并后用饱和氯化钠溶液洗涤1 次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩，柱色谱（流动相为DCM）得黄色固体化合物4a～4g。

合成的7 个目标化合物的理化常数和波谱数据分别见表1和表2。

Table 1 Yield and physical properties of compounds 4a-4g

Table 2 IR, 1H NMR and MS datas of compounds 4a-4g

（Continued）

2.3 细胞毒活性测试

以先导化合物大黄酸和临床常用抗肿瘤药物氟尿嘧啶（5-FU）为阳性对照，采用MTT 法测试目标化合物对人肝癌细胞HepG2、Bel-7402，人结肠癌细胞HCT116，人骨肉瘤细胞U2OS，耐药细胞Bel-7402/5-FU 及正常肝细胞LO2 的体外抗细胞增殖活性。细胞在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。取处于对数生长期状态良好的细胞，加入消化液（0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA）消化，制成每毫升2×104～4×104个细胞的细胞悬液，接种于96 孔板上，每孔加180 μL，置恒温CO2培养箱中培养24 h。更换培养液，加入受试药物（0.16～25 μmol/L，5 个浓度），每孔20 μL，培养48 h。将MTT加入96孔板中，每个孔20 μL，培养箱中孵育4 h。吸去上清液，加DMSO，每孔150 μL，平板摇床上振摇10 min，用酶联免疫检测仪测定每孔在波长为570 nm处的吸收度，计算IC50。

2.4 NO释放量的测定

将1×106个HepG2 细胞置于6 孔板中孵育过夜。向每孔中分别加入100 μmol/L 化合物4g 孵育150 min。收集细胞并将其裂解，在96 孔板中加入裂解液50 μL，再分别加入一氧化氮检测试剂盒中Griess 试剂Ⅰ和Ⅱ50 μL，于37 ℃孵育10 min，测定在540 nm 处的吸收度。只用DMSO 给药处理的细胞作为亚硝酸盐产物的背景的阴性对照，以不同浓度的亚硝酸钠作标准曲线，根据标准曲线计算NO的浓度。

2.5 NO清除剂对化合物4g活性的影响

用NO 清除剂血红蛋白检验NO 释放对化合物4g 活性的影响。方法参照“2.3”项，取人肝癌细胞HepG2 细胞，将血红蛋白（终浓度10 μmol/L，未见显著的细胞毒性）先于受试药物1 h 加入培养基，再用受试药物4g（终浓度12.5 μmol/L）处理72 h，采用MTT法检测细胞抑制率。

3 结果与讨论

3.1 合成部分

在合成目标化合物的过程中，本研究曾参考前期类似化合物的合成方法，即以大黄酸和羟烃氧基取代的呋咱在脱水剂EDCI/DMAP 作用下一步反应成酯，实验发现产率低，且后处理操作繁琐。为此，改用酰氯成酯的方法，即大黄酸经二氯亚砜卤代得到大黄酰氯（2），再与不同的羟烃氧基取代的呋咱反应得到目标化合物（4a～4g）。考虑到所制备的大黄酰氯没有经过精制处理，在设计反应物配比时，加大了酰氯的用量。多次的实验表明，大黄酰氯与羟烃氧基呋咱物质的量比1.5∶1为最佳，反应温度为先冰盐浴中滴加酰氯，后室温反应。实验结果表明，以此法制备目标化合物，反应能较好地进行，且后处理方便，反应收率较高，可达68%以上。

3.2 细胞毒活性

为了研究目标化合物的抗肿瘤活性，以先导化合物大黄酸和抗肿瘤药物5-FU 为阳性对照，采用MTT 法测试了目标化合物对人肝癌细胞HepG2，Bel-7402，人结肠癌细胞HCT116，人骨肉瘤细胞U2OS，耐药细胞Bel-7402/5-FU 及正常肝细胞LO2的体外抗细胞增殖活性。实验结果见表3。

Table 3 Effects of target compounds against six human cancer cell lines

由表3 可知，大黄酸呋咱偶联物对所测试的6 种人类肿瘤细胞均表现出一定的增殖抑制活性，且全部目标化合物对肿瘤细胞的抑制活性远高于先导化合物大黄酸，绝大部分目标化合物的抗肿瘤活性与阳性对照药5-FU相当或更强。不同的化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用有所不同，比如：所有受试化合物对Bel-7402，HepG2，U2OS，Bel-7402/5-FU 等细胞株的增殖抑制作用明显，其IC50均为较低的个位微摩尔浓度，抗细胞增殖效果均明显优于阳性对照5-FU，其中，化合物4g 对Bel-7402 细胞的抑制活性最强，其抑制活性是5-FU 的6 倍；对人结肠癌细胞HCT116 和人胃癌细胞HGC27，不同的化合物所呈现的抑制作用差异较大，化合物4f 和4g 活性较弱，其IC50大于12.5 μmol/L，而化合物4a～4e 则表现出与阳性对照药5-FU 相当或更强的抑制活性，说明当连接臂为饱和直链烷烃时，碳链长短对其活性影响较小；当连接臂为不饱和烃基（如化合物4g）或连接臂中含杂原子（如化合物4f）时，抗HCT116和HGC27的活性较差。值得注意的是，所合成的目标化合物对耐药细胞株Bel-7402/5-FU 表现出较强的抑制活性，其抑制活性是5-FU 的37～88 倍，显示较好的抗耐药特性。为了探明目标化合物是否具有选择性抗肿瘤作用，本研究进一步考察了目标化合物对人正常肝细胞LO2的影响。研究发现，1 μmol/L的化合物4a～4g 对LO2 的增殖抑制活性差异较大：化合物4g 和4f 对LO2 几乎没有影响，抑制率分别为3.80%和3.44%；化合物4a 和4c 对LO2 的影响也很小，抑制率小于10%，分别为7.48%和7.12%；而化合物4b，4d 和4e 对LO2 的影响较大，抑制率分别为14.36%，27.61%和22.09%。综上所述，化合物4g 不仅对人肝癌细胞HepG2、Bel-7402，人骨肉瘤细胞U2OS 及耐药细胞Bel-7402/5-FU 表现出强的增殖抑制活性，而且对正常细胞影响很小，表现出较好的选择性，值得进一步研究。

3.3 化合物4g的溶解性及对肿瘤细胞中NO释放的影响

由于大黄酸在水中不溶，在乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂中极难溶解（＜0.5 mg/mL），在一定程度上影响其药效的发挥。本研究通过对大黄酸的修饰，以期改善其溶解性能。经测定，体外抗肿瘤活性最好的目标化和物4g 在水中的溶解度与大黄酸相似（＜0.5 mg/mL），但在乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂中溶解度较大黄酸有了一定程度的改善：乙醇（＞0.1 mg/mL）、丙酮（＞1 mg/mL）、乙酸乙酯（＞0.33 mg/mL）、二氯甲烷（＞2 mg/mL）。

本研究设计的目标化合物是由NO 供体与大黄酸通过连接臂偶联而成，期望得到的化合物能够在体内通过协同效应增强其抗肿瘤活性。为了证实目标化合物抗肿瘤作用是否与NO 释放相关，本研究选取体外抗肿瘤活性最好的化合物4g进行体外NO 释放检测，并用NO 清除剂进行验证。参照文献，采用Griess 法［23］测定了活性目标物4g 对肝癌细胞HepG2 中NO 释放量的影响。经受试药物4g（100 μmol/L）处理后，HepG2 细胞中NO 释放量达20.1 μmol/L。为证明NO 与抗肿瘤活性之间的关系，本研究选用NO 清除剂（血红蛋白）进行验证。实验结果表明，血红蛋白可以显著抑制化合物4g 的细胞毒性（其抑制率由未加清除剂时的80.68%降至44.58%），这一试验结果证明了目标化合物4g的抗肿瘤活性部分来自于NO的释放。