白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠Nrf2/HO-1信号通路的影响

樊 荣,李 龙,乔中原,王俊平,张 琪,马 磊

(1.西安市第一医院，陕西 西安 710002； 2. 西北大学附属第一医院，陕西 西安 710002；3. 西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004)

随着我国步入老龄化社会，心血管疾病的发病率逐渐升高。虽然心脏手术可延缓一些心脏相关致死疾病的发生，但是在手术后缺血再灌注给心肌带来的损伤不可避免[1]。近年来研究发现，黄酮类药物预防给药可明显减轻心肌缺血再灌注损伤造成的心肌损害[2-3]。白杨素是黄酮类化合物的一种，化学名为5，7-二羟基黄酮，其首先于紫葳科植物木蝴蝶中被发现，而在蜂胶中广泛存在。相关文献报道，白杨素可明显减轻炎症反应，提高机体抗氧化能力，对心肌具有一定的保护作用[4-5]，但是其用于心肌缺血再灌注损伤的研究少见。为此本研究构建了心肌缺血再灌注损伤动物模型，观察了白杨素对心肌损伤是否有保护作用，并尝试从Nrf2/HO-1信号通路阐明其作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠60只，购于西安交通大学医学院动物实验中心，动物合格证号：SYXK(陕)2018-001，动物购买后饲养于实验中心，5只/笼，由实验中心专业人员统一喂养和管理。

1.1.2药物与试剂 白杨素(98%)由陕西慈缘生物技术有限公司提供； 雷米普利购于昆山龙灯瑞迪制药有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧簇(ROS)试剂盒购于武汉博士德生物科技公司；核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购于Abcam公司，辣根酶标记的二抗购于武汉谷歌生物科技有限公司，引物由上海生物生工生产。

1.1.3仪器 全自动生化分析仪(C8000型，美国雅培公司)；酶标仪[Infinite F50型，勒菲生物科技(上海)有限公司]；紫外可见分光光度计(919型，德国MACHEREY-NAGEL公司)；低温高速离心机(TDL80型，德国BC公司)；-86 ℃超低温冰箱(DW-HL678型，美菱生物医疗)；凝胶电泳仪系统(BR型，美国Bio-Rad公司)；实时荧光定量PCR仪(QuantStudio 3型，赛默飞世尔中国)。

1.2实验方法

1.2.1分组及干预 按照随机数字法将大鼠分为假手术组、模型组、雷米普利组、白杨素低剂量组、白杨素中剂量组和白杨素高剂量组，每组10只。分组适应性喂养1周后，雷米普利组给予雷米普利1.0mg/(kg·d)灌胃，白杨素低、中、高剂量组分别给予白杨素10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)灌胃，假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，均灌胃2周。

1.2.2心肌缺血再灌注损伤模型构建 参照文献[6]中方法造模：实验开始时所有大鼠禁食不禁水12 h，后分批次给予1%的戊巴比妥钠5 mL/kg 腹腔注射麻醉，麻醉后将其固定于解剖版，气管插管、连接动物呼吸机，连接并检测心电图。后沿胸左侧第三和第四肋骨之间行开胸手术，分离包膜后充分暴露心脏，剪开心包膜，采用无损伤缝线在平左心耳下缘1～1.5 mm 处进针，后沿左前降支后出针，拉紧结扎线行结扎手术(假手术组不结扎)，当肉眼可见有明显左心室苍白，同时心电图ST段抬高即达到缺血目的。于结扎30 min后，恢复供血120 min即再灌注损伤模型造模成功。

1.2.3血液和组织收集 再灌注结束后，用注射器抽取股动脉血液约5 mL，一部分置入抗凝管中完成心肌酶检测，其余采用低温高速离心机离心(4 ℃，3 000 r/min，15 min)后收集血清，置入超低温冰箱备用；取出心脏，将心脏横切，一部分置入组织固定液中固定，一部分置入超低温冰箱中备用。

1.3检测指标与方法

1.3.1心肌组织HE染色病理学观察 参考文献[7]方法，取出组织固定液固定后的心肌组织标本，依次经包埋、切片、洗涤、苏木精染色、伊红复染、脱水、封片后，采用荧光倒置显微镜观察，每张切片随机选取4个不同的视野。

1.3.2生化指标检测 采用双抗体夹心法测定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、血浆肌钙蛋白 I(cTnI)水平，根据试剂盒说明书测定血液和心肌组织中氧化和抗氧化指标SOD、MDA和ROS水平。

1.3.3心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达检测 采用Western blot法检测：从超低温冰箱中取出心脏组织，称取100 mg后置入离心管中，加入1 mL组织裂解液将其充分撵磨，提取上清后定量并调平，然后每组各取50 μg行聚丙烯酰氨凝胶电泳，完成后切取目的蛋白，采用半干转移法转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗孵育，洗涤后加入二抗孵育，暗室曝光洗片即可。采用Image 软件分析结果，以观察指标的灰度值与 β-actin 条带灰度值的比值作为蛋白的相对表达量。

1.3.4心肌组织中Nrf2和HO-1 mRNA表达检测 称取20 mg心肌组织，采用试剂盒提取总RNA后，将其逆转录为cDNA，每组各取2 μL行扩增反应，扩增条件：94 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环，以GAPDH作内参，结果采用2-△△Ct法比较分析。引物序列：Nrf2上游引物为5’-CGGCTAGATGGCTAACTGAGTGGC-3’，下游引物为5’-GATTTGGCGATTGCTGCTCAGC-T-3’，产物长度为86bp；HO-1 上游引物为5’-TCCATGGGTTTGCCACACTC-3’， 下游引物为5’-AAGAGCCAAGCAAAGGCGA-3’，产物长度为98 bp；GAPDH上游引物为5’-GGACTAGCTACTGACCC-TC-3’，下游引物为5’-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，产物长度为117 bp。

2 结 果

2.1各组大鼠心肌组织HE染色表现 假手术组大鼠心肌纤维完整，基本没有断裂，纤维排列整齐；模型组出现明显心肌纤维排列紊乱和断裂，各药物组心肌组织病变程度明显轻于模型组。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色表现(×400)

2.2各组大鼠血清心肌酶学指标比较 模型组大鼠血清CK、CK-MB、LDH和cTnI水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，各药物组上述指标水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且白杨素高剂量组LDH水平明显低于雷米普利组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清心肌酶学指标比较

2.3各组大鼠血清和心肌组织中氧化和抗氧化指标水平比较 模型组大鼠血清和心肌组织中MDA和ROS水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，SOD水平均明显低于假手术组(P均<0.05)；各药物组大鼠血清和心肌组织中MDA和ROS水平均明显低于模型组(P均<0.05)，SOD水平均明显高于模型组(P均<0.05)；白杨素高剂量组血清和心肌组织中MDA、ROS水平及白杨素中剂量组血清和心肌组织中ROS水平均明显低于雷米普利组(P均<0.05)。见表2和表3。

表2 各组大鼠血清氧化和抗氧化指标水平比较

表3 各组大鼠心肌组织中氧化和抗氧化指标水平比较

2.4各组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)，各药物组上述指标均明显高于模型组(P均<0.05)；白杨素中、高剂量组Nrfz蛋白表达量和HO-1蛋白及mRNA表达量均明显高于雷米普利组(P均<0.05)，且白杨素高剂量组Nrfz mRNA表达量明显高于雷米普利组(P<0.05)。见图2和表4。

A为假手术组；B为模型组；C为雷米普利组；D为白杨素低剂量组；E为白杨素中剂量组；F为白杨素高剂量组图2 各组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达灰度图

表4 各组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA相对表达量比较

3 讨 论

缺血再灌注损伤是心肌梗死手术治疗中常见的并发症，其严重影响患者预后[8]，因此对缺血再灌注损伤的及早预防或在发生后积极治疗非常重要。

黄酮是许多植物药的有效活性药理成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、有效保护心肌、抵抗糖尿病肝脏和肾脏损伤等多种生物活性[9-11]。白杨素是天然黄酮类化合物的一种，其可促进肿瘤细胞凋亡，还可抑制病态血管生成，抗高血压、降血糖等[12-15]，但其对心肌缺血再灌注损伤是否有保护作用尚不明确。本实验观察了白杨素预防给药对心肌损伤的保护作用，病理结果显示各药物组大鼠心肌损伤均较模型组减轻，提示白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌具有一定的保护作用。

心肌酶谱是临床中判断心肌损伤程度的一类核心指标，主要包括LDH、CK、CK-MB、α-HBD和cTnI等[16]。在正常生理条件下，血清心肌酶水平较低，而在缺血再灌注损伤发生后，心肌细胞受到损失会导致相关心肌酶释放入血液而升高。此外心肌细胞受损后许多活性氧自由基包括MDA和ROS也可释放到血液中[17]。本实验结果显示，模型组大鼠血清LDH、CK、CK-MB、cTnI水平及血液和心肌组织中MDA、ROS水平均明显升高，而各药物组上述指标水平均明显低于模型组；模型组大鼠血液和心肌组织中SOD水平均明显降低，而各药物组均明显高于模型组。提示白杨素预防给药可以明显提高缺血再灌注损伤大鼠心肌抗氧化能力，保护心肌。

Nrf2-ARE信号通路主要调控SOD和GSH等抗氧化酶系的表达，与机体氧化应激反应密切相关[18]。缺血再灌注损伤发生后，MDA和ROS等过量表达可引起Nrf2蛋白和Keapl蛋白解耦联，Nrf2蛋白在解耦联后可进入细胞核，激活一些抗氧化因子如HO-1的表达，进而提高机体的抗氧化能力[19]。HO-1是机体最主要的内源性保护酶，其可以促进SOD和GSH生成，进而保护细胞免受氧化损伤[20-21]。本实验结果显示，模型组大鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表达量均明显高于假手术组，各药物组上述指标表达量均明显高于模型组。这提示在心肌缺血再灌注损伤发生后，机体本身有一定的自我调节能力，而白杨素预防给药能够进一步提高心肌组织抗氧化能力，进而保护心肌。

综上所述，白杨素预防给药可明显改善心肌缺血再灌注造成的心肌损伤，可能与其可提高心肌组织中Nrf2和HO-1表达，进而提高心肌抗氧化能力有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。