表观遗传修饰在支气管肺发育不良发病机制中作用的研究进展

霍梦月, 梅 花

（内蒙古医科大学附属医院新生儿科，内蒙古 呼和浩特 010050）

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）多见于小早产儿或极低出生体质量儿，是目前新生儿科最常见且最棘手的呼吸系统危重疾病之一。随着近年来产前生育管理工作的完善和产后新生儿救治水平的不断提高，早产儿的生存率逐年升高，但BPD 的发病率并未降低却呈逐年上升的趋势［1-2］。BPD 不仅发病率高，其严重的远期后遗症也是临床医生必须面对的问题［3］。当前BPD 的治疗方式主要为对症支持治疗，尚无一项特异性治疗能改善BPD 患儿的症状和远期预后［4］，因此，深入研究BPD 的发病机制，明确如何早期预测BPD，寻找有效的防治手段对提高早产儿存活率、减少儿童致残率和提升儿童生活质量具有重要意义。目前国内外学者认为BPD 是多种因素共同作用的结果，各因素之间既相互独立又相互渗透，共同参与BPD 的发生发展。PARKER 等［5］对双胞胎的研究显示：BPD 发生率在双胞胎中存在高度的一致性，首次发现了遗传学在BPD 中的作用。研究［6］显示：BPD 的发病机制涉及遗传因素和环境因素之间复杂的相互作用，是在遗传易感性的基础上，因多种内源性和外源性刺激导致炎性级联反应，进而对未成熟肺组织造成的损伤以及损伤后肺血管发育的失控和肺组织的异常进行修复。但目前国内外关于表观遗传修饰在BPD 发病机制中作用的研究仍较为有限，因此，本研究以遗传易感性为切入点，探讨表观遗传修饰在BPD 发生发展中的作用机制，为BPD 的防治提供新方向。

1 表观遗传学概述

表观遗传学是与遗传学相对的概念，其研究的主要目的是探讨非遗传因素如何在DNA 核苷酸序列不发生改变的前提下调控基因的表达，并发挥其在疾病发生发展中的作用，因此表观遗传学在整合遗传因素与环境因素中起关键作用［7］。常见的表观遗传修饰包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），除此之外，染色体失活和构型重塑亦属于表观遗传修饰范畴［8］。目前已有研究［9］证实：表观遗传修饰可参与自身免疫性疾病、糖尿病、风湿性疾病和恶性肿瘤等多种疾病的基因调控过程。研究［10］显示：表观遗传学是肺发育过程中重要的调控机制之一，且BPD的发病机制多有表观遗传效应。因此，深入研究表观遗传学在BPD 发生发展中的作用可能对阐明BPD 的病理生理机制和提供新的治疗靶点具有重要意义。

2 表观遗传学在BPD 中的作用

2.1 DNA 甲基化与BPDDNA 甲基化是S-腺苷甲硫氨酸中的甲基在DNA 甲基转移酶（DNA methyl transferases，DNMT）的作用下，与DNA上CG 二核苷酸序列胞嘧啶中的第5 位碳原子通过共价键的形式结合，进而生成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程，是迄今为止研究最深入的表观遗传调控方 式［11］。常见的DNMT包括DNMT1 和DNMT3 a/b，在DNA 复制过程中，DNMT1 可将双亲DNA链中原有的甲基化模式完整地复制到新合成的子链上，而DNMT3a/b 主要负责在尚未经过修饰 的DNA模板上建立新的DNA甲基化模式［12］。研究［13］显示：DNA 甲基化可通过干扰转录因子结合、印记基因中单等位基因的表达、DNA上启动子对转录因子的选择性暴露、细胞分化和胚胎发育等一系列关键过程，在表观遗传水平调控基因表达。近些年，随着表观遗传学研究的不断深入发现：DNA 甲基化不仅与肿瘤性疾病密切相关，而且其在BPD 等呼吸系统疾病中亦扮演重要角色。

矮小相关转录因子3（Runt-related transcription factor 3，RUNX3）是一类肺发育相关基因，与肺上皮细胞分化和肺血管发育密切相关，可通过DNMT1 和DNMT3b 介导的DNA 甲基化在转录后水平调节其表达，而组蛋白H3 第27 赖氨酸三甲基化（trimethylation of lysine 27 on histone H3，H3K27me3）是表观遗传学中最常见的一种修饰方式，因此，美国一项研究［14］首先于动物水平发现：在高氧诱导新生鼠BPD 模型的RUNX3 基因启动子区域存在DNA 甲基化和H3K27me3 这2种表观遗传修饰方式，该团队进一步于细胞水平验证了上述结果，提示表观遗传修饰可能在BPD 的形成过程中具有重要作用。CUNA 等［15］通过微阵列技术与DNA 甲基化测定相结合的方式分析人类基因表达与DNA 甲基化关系研究，结果显示：在BPD 患儿中，包括谷胱甘肽S-转移酶M3（glutathione Stransferase M3，GSTM3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）在内的23个基因的表达水平与甲基化水平呈负相关关系，提示这些基因可能参与了BPD 的表观遗传修饰。国外学者通过对BPD 患儿进行尸检证实：与死于非呼吸道疾病的患儿比较，BPD 患儿肺组织中miR-17～92 基因簇的所有成员表达水平均明显降低，且其降低程度与各miRNA 基因启动子区域的甲基化水平呈负相关关系［16］，上述结论也在随后的动物实验中得到证实，提示miR-17～92 基因簇可能通过增强基因启动子区域的甲基化水平进而参与BPD 的发生发展［17］。

动物水平的研究［18-21］显示DNA 甲基化修饰可能参与了BPD的形成。CHEN等［18］首先证实了高氧性肺损伤模型的肺表型与BPD极为相似，随后采用DNA 甲基化免疫共沉淀法对大鼠肺组织进行全基因组DNA 甲基化分析，结果显示：DNA 甲基化可能参与了高氧诱导新生鼠的肺泡化阻滞过程。BIK-MULTANOWSKI等［19］采用微阵列技术分析高氧诱导新生大鼠BPD 模型肺组织中甲基化水平，结果显示： 高氧组大鼠转化生长因子β 受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）和环腺苷酸反应成分结合蛋1（cyclic adenylate response component binding protein 1，CREB1）等基因启动子区域DNA 甲基化水平高于空气组，为BPD 可能存在DNA 甲基化的表观遗传效应提供了理论依据。研究［20］显示：对BPD 小鼠肺组织进行甲基化分析发现高氧使磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）- 蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路的表达出现明显变化，该途径的关键元件如AKT、PI3K 和10 号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）等均被高度甲基化，提示BPD 的基因调控可能涉及表观遗传因素，与CHENG 等［21］研究结果一致。

综上所述，在BPD 的发病过程中可能存在异常的DNA 甲基化过程，DNA 甲基化有望成为BPD潜在的治疗靶标。

2.2 组蛋白修饰与BPD组蛋白是核小体的重要组成部分之一，一个核小体由长度约为146 bp 的双链DNA 包裹着8个核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4 各2个）组成［22］。组蛋白修饰作为表观遗传学重要组成之一，可通过多种翻译后修饰过程参与调节染色质状态和转录活性，进而调控基因表达［23］。组蛋白不仅能影响基因表达，还可招募蛋白复合体，通过影响下游蛋白表达而参与细胞分裂和细胞凋 亡等多种生物过程［24］。研究［25］证 实：组蛋白修饰在肺癌、肺动脉高压和BPD 等多种呼吸系统疾病的发病机制中起重要作用。这使得表观遗传修饰机制成为当前的研究热点之一。

在BPD 的发病机制中，组蛋白修饰通常以乙酰化和去乙酰化为主。多数情况下，组蛋白乙酰化主要参与基因转录过程，而组蛋白去乙酰化则多与基因沉默有关，两者动态配合共同调控组蛋白的乙酰化修饰。组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）是组蛋白乙酰化过程中的关键酶，可催化组蛋白赖氨酸残基上的氨基发生乙酰化，加入的乙酰基通过中和带正电的组蛋白复合物减弱组蛋白与DNA 之间的相互作用，使染色质结构变得疏松，从而激活基因转录过程［26］。为探讨BPD 中可能存在的表观遗传机制，CHAO 等［27］将小鼠置于高氧环境构建BPD模型，结果显示：高氧组小鼠肺内皮细胞一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）和信号转导与转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）mRNA 表达水平明显升高，且NOS3 和STAT3基因位点均发生H2aZ和H3K9组蛋白乙酰化修饰，研究者进一步采用体外细胞培养实验验证了上述结论，提示NOS3 和STAT3 基因位点组蛋白乙酰化修饰可能是早产儿发生BPD 的主要原因之一。美国一项针对54例胎龄小于28周的早产儿进行横断面研究［28］结果显示：出生后逐渐发展成BPD 的患儿存在组蛋白乙酰化和染色质重塑这2种表观遗传途径，提示组蛋白乙酰化和染色质重塑可能是BPD 潜在且可行的表观遗传治疗手段。

与组蛋白乙酰化过程相反，组蛋白去乙酰化是通过促进核小体及其周围DNA 的紧密结合而发挥基因转录沉默的作用，该过程由组蛋白去乙酰化酶（histone deacetytlases，HDACs）催化。HDACs 是一个大家族，其中Ⅰ类HDACs 定位于细胞核，主要包括HDAC1 和HDAC2，具有较强的组蛋白去乙酰化酶活性。HDAC1 和HDAC2 对胚胎发育至关重要，并可通过基因组和非基因组效应调节细胞增殖和分化等生物学过程。LONDHE 等［29］利用动物模型为BPD 的发病机制提供了新的证据，即高氧导致肺泡发育不良的部分机制可能是通过降低HDAC1 和HDAC2 的表达水平来实现的，与ZHU 等［16］的 研究结果一致。有研究者［30］向孕鼠羊膜腔内注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）构建绒毛膜羊膜炎模型，之后对新生小鼠肺组织进行病理学观察发现：其病理学特点主要表现为肺发育受阻，与BPD 的肺表型十分相似，进一步对小鼠肺组织中HDAC1 和HDAC2 的表达水平进行检测，结果显示：与对照组比较，LPS 诱导组小鼠肺组织中HDAC1 和HDAC2 表达水平均降低，提示HDAC1/2 可能在阻止肺泡发育进程中起重要作用。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）是一种组蛋白去乙酰化酶，MODY 等［31］共采集了51例婴儿的130份气管吸出液标本，对标本进行相应检查后发现：BPD 患儿Sirt1 表达水平较非BPD 患儿明显降低，提示组蛋白去乙酰化可能与BPD 的发病密切相关。最新研究［32］显示：全身脓毒症可导致发育中的肺出现急性炎症反应，进而表现出肺泡结构简单化等类似于早产儿BPD 的肺表型，而HDACs 抑制剂能进一步增强脓毒症引起的炎症反应，影响肺发育并加重BPD，表明HDACs 抑制剂可能在BPD 的形成中起重要作用。

上述研究均提示组蛋白乙酰化和去乙酰化可能是BPD 潜在的分子调控机制，因此以组蛋白修饰为契机，探讨BPD 的表观遗传修饰方式可能是今后研究BPD 发病机制的新思路。

2.3 ncRNA 与BPDncRNA 是指从DNA 转录而来，但不能翻译成蛋白质的功能性RNA，约占人类基因组的98%［33］。根据ncRNA 的长度可将其分为短链非编码RNA（＜30 nt）和长链非编码RNA（long no-coding RNA，lncRNA，＞200 nt），前者又分 为miRNA、小 干 扰RNA（short interfering RNA，siRNA）和 Piwi-interacting RNA（piRNA）［34］。作为一种新型表观遗传调节因子，ncRNA 在细胞和分子水平上的表观遗传调控功能也逐渐被揭示出来，如ncRNA 可通过调控染色质重塑、转录和转录后过程影响基因的表达，进而在多种生物过程中发挥关键的调节作用。

作为强大的基因表达调控因子之一的miRNA，可通过阻碍mRNA 翻译或指导mRNA 降解，从而在转录后水平沉默基因表达［35］。miRNA是个庞大的家庭，其广泛存在于动植物和微生物中，并在多种生物过程中具有重要功能，因此成为当今的研究热 点［36］。人类超过60%的mRNA是由miRNA 直接调控的，miRNA虽然仅占人类基因组的2%，但将近30%的基因均受其调控［37］。表观遗传现象可以导致miRNA 的调控失调，而一些miRNA又可以控制表观遗传调节因子，因此，miRNA是理解疾病机制、生物标志物和治疗干预的潜在靶点［38］。

迄今为止，在BPD 的肺泡间隔阶段共发现19个miRNA表达上调，26个miRNA表达下调，提示miRNA 在BPD的发生发展中可能起重要作用［39］。LAL 等［40］前期研究已证实：患儿出生时miR-876-3p 表达降低对预测极低出生体质量儿发生严重BPD 有很大潜力。研究［40］显示：BPD 模型中异常的肺泡结构可通过miR-876-3p 功能的增加而得到改善，提示miR-876-3p 可预测并阻止早产儿BPD 的发生，为miRNA 成为BPD 预测性生物标志物提供了有力证据。临床研究［37］显示：诊断为BPD的早产儿血清中miR-29b 表达水平下调。进一步的动物实验［37］证实给予严重BPD小鼠外源性注射miR-29b 可改善其肺表型，因此miR-29b 可能是治疗或预防早产儿严重BPD 的一种新策略。SUN 等［41］采 集20例BPD 患儿和20例对照组患儿的外周血，采用微阵列技术筛选2组患儿差异表达的miRNA 并进行验证，结果显示：BPD组患儿血清miR-495-5p 的表达水平较对照组明显增加，进一步采用靶基因数据库预测miR-495-5p 靶基因，结果共预测了117个miR-495-5p 的靶基因，这些靶基因多与细胞凋亡、细胞自噬、转录调控和血管生成等多种生物过程有关，提示miRNA-495-5p 可能通过参与上述生物调控过程进而参与早产儿BPD的发生。

在高氧诱导的BPD 小鼠模型中，同样发现多个与BPD 密切相 关的miRNA。有学者［42］采用高通量测序技术检测高氧诱导的BPD 小鼠模型中miRNA 表达谱的研究显示：共有201个miRNA 在2组小鼠中存在差异表达，其中miR-342、miR-335、miR-150、miR-126 和miR-151 表达下调，而miR-21 和miR-34a表达上调。有 研究［43］证 实：长期持续吸入高氧的新生小鼠肺组织中miR-30a 呈高表达，在高氧暴露21d时雌性小鼠肺组织中miR-30a 表达水平明显高于雄性小鼠，提示miR-30a 表达上调可能与BPD 有关并存在性别差异。SYED 等［44］发现：暴露于高氧环境的新生小鼠肺组织中miR-34a 表达水平明显升高，抑制miR-34a表达可改善BPD 小鼠模型中BPD 及相关的肺动脉高压症状，相反，miR-34a 过表达使症状加重，提示miR-34a 抑制剂可能是预防或改善BPD 的治疗方式之一。既往研究［45］已证实：成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）是miR-421的靶基因。研究 者［45］通过高氧诱导构建小鼠BPD 模型，进一步探讨miR-421 在小鼠BPD模型中作用机制的结果显示：高氧组小鼠肺组织中miR-421 表达水平明显高于对照组，且FGF10 表达水平明显低于对照组，提示miR-421 表达水平上调和FGF10 沉默不仅会加剧BPD 肺组织的炎症反应，还可加重细胞凋亡情况，同时上述改变可以通过下调miR-421 表达来逆转，为BPD 的治疗提供了可能的药物靶点。

上述基于临床和动物水平的研究均证实：miRNA 在研究BPD 发病机制和基因靶向治疗方面具有重要意义。

lncRNA 是指转录本长度超过200个碱基的ncRNA，约 占ncRNA总数的80%［46］。与miRNA一 样，研究［47］显示： lncRNA在转录、翻 译、RNA代谢、染色质修饰、干细胞维持和分化、细胞自噬和凋亡及胚胎发育等方面均发挥重要作用。lncRNA 不仅可通过作为染色质修饰复合物的支架发挥表观遗传功能，还能作为转录调节因子直接对转录过程进行调节。除了在细胞核中的作用外，一些反义lncRNA还可与mRNA 的3′非翻译区（3′UTR）结合，调节其在细胞质中的稳定性及其与miRNA 的相互作用［48］。由于lncRNA 与多种疾病的发生均有密切的联系，其已成为近年来疾病机制研究的重点领域，有望为疾病的治疗和预防提供新思路。

转移相关肺腺癌转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是长度约为8 778 bp的lncRNA。研究者［49］通过分析基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）中 的GSE25286数据集以明确MALAT1 在BPD 小鼠肺组织中表达的结果显示：BPD组小鼠肺组织中MALAT1 的表达明显上调。早产儿外周血标本验证［49］结果也表明BPD 早产儿血液样本中MALAT1 表达水平明显升高，提示lnRNA MALATl的差异性表达与BPD 的发生发展密切相关，为BPD 的临床诊断及治疗提供新的理论依据。国内一项研究［50］收集早产儿2～5 mL脐带血和BPD患儿2 mL 外周静脉血，采用荧光定量PCR 技术检测脐带血及外周血中lncRNA_AK096792 相对表达水平的结果显示：BPD组患儿脐带血中lncRNA_AK096792 表达水平明显高于非BPD组，且BPD 患儿外周血中lncRNA_AK096792表达水平明显高于脐带血，提示lncRNA_AK096792的表达水平可作为BPD潜在的生物标志物之一。

BAO等［51］的研究首次揭示了高氧组与对照组小鼠肺组织中lncRNA 表达的差异，即BPD组小鼠肺组织中882个lncRNA 表达上调，887个lncRNA表达下调，提示这些lncRNA可能参与了BPD的发生发展，为进一步了解BPD发生的分子机制奠定了基础。包天平等［52］采用逆转录PCR技术检测BPD小鼠中lncRNA 1010001N08Rik 和Gata 6mRNA 变化的情况，结果显示： lncRNA 1010001N08Rik 的表达水平与氧暴露时间呈正相关关系，而Gata 6 mRNA 表达水平与氧暴露时间呈负相关关系，提示lncRNA 1010001N08Rik 可能通过下调Gata 6 的表达而在BPD 形成过程中起促进作用。CHENG 等［21］首先通过高氧诱导构建了新生鼠BPD 模型，进一步采用Illumina 测序技术分析2组中lncRNA 的差异表达，并进行GO 和KEGG富集分析结果显示：高氧组有30 225个与lncRNA相关的基因表达，对照组有30361个与lncRNA相关的基因表达，提示2组lncRNA 的表达存在差异。该研究者同时发现：高氧组和对照组共检测到1 175 条不同的lncRNA，其中544条表达上调，631条表达下调；GO富集分析结果显示：共发现673个GO功能富集差异有统计学意义，且主要与细胞定位等生物学过程有关；KEGG 富集分析结果显示：lncRNA参与了257条KEGG途径，该实验验证了其中的9个lncRNA，高氧组与对照组验证的lncRNA 数比较差异均有统计学意义，因此该研究者认为lncRNA 可能参与BPD 的发生，为探索BPD的生物学过程提供了新的认识角度。

综上所述，lncRNA 有望成为BPD 诊断和治疗的新型分子靶标之一，其具有重要的临床应用前景。

3 展 望

尽管国内外医务人员在防治BPD 方面做出了不懈的努力，但在降低BPD 发生率方面取得的进展仍非常有限，因此，深入研究BPD 的发病机制迫在眉睫。表观遗传学凭借其可遗传性和可逆性的特点已为多种疾病的预防和治疗提供了新思路，然而目前国内外关于BPD 表观遗传学分子机制研究的文章仍较有限，大样本多中心的临床研究也较少，因此进一步阐明BPD分子遗传学机制不仅能加深人们对BPD 具体发病机制的认识和理解，还能为BPD 的分子靶向治疗带来新的突破和进展。