单基因病扩展性携带者筛查研究进展

张春燕，田亚平

解放军总医院医学创新研究部 出生缺陷防控技术研究中心，北京 100853

孕前携带者筛查是阻止出生缺陷的一级预防措施。高通量测序技术在医学领域的广泛应用形成了可用于多基因携带者筛查的扩展性携带者筛查技术(expanded carrier screening，ECS)。ECS通过检测多种基因，可以同时筛查几十种、几百种甚至上千种疾病，筛查效率大大提高。为此，自2008年以来美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)、美国妇产科学会(ACOG)等国际学术机构分别发布了近5项指南和指导意见、建议，对ECS的临床应用进行推荐和指导[1-2]。国外相对较早开展了ECS工作和研究，近年来随着高通量测序技术在国内的应用和普及，以及出生缺陷一级防控的迫切需要，国内临床机构和第三方实验室陆续开展ECS，本文总结了国内外ECS相关研究和工作，以期为ECS开展提供理论基础。

1 单基因病致病基因携带

出生缺陷给患儿和家庭带来极大的痛苦和负担，出生缺陷儿中约30%在5岁前死亡，40%为终身残疾。单基因病是出生缺陷重要病因之一，其单病种发病率低，但综合发病率高，超过1/100(www.who.int)。在2018年公布的我国《第一批罕见病目录》中单基因遗传病就占到了大多数[3]。随着基因技术临床应用的发展，近年来每年新发现近100种新遗传病。根据OMIM数据库显示，截止到2021年1月1日，明确的单基因病有8590种(www.omim.org/statistics/entry)，其中明确的常染色体和性染色体隐性遗传病有1300多种[4]。在活产新生儿中，以隐性遗传方式为主的遗传代谢病(inborn errors of metabolism，IEM)的总体发病率高达1/500，且往往导致严重病情[5]。通过近30年我国IEM的筛查显示，苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)和先天性甲状腺功能减退症(congenital hypothyroidism，CH)的发病率由之前的1/15930和1/6309升至1/11627和1/2032[6]，原因可能是新生儿筛查的普及使得我们能在更早期发现患儿，或强制婚检取消而导致的出生缺陷一级预防方案和技术的缺乏[7]。在中国南方，出生缺陷的代表性疾病如地中海贫血是一种重要的隐性遗传疾病，在广西、海南、云南、广东、贵州等南方省份其人群基因携带率达20%以上[8]。2019年，Coughlin等[9]报道了关于ALDH7A1基因变异导致吡哆醇依赖性癫痫的调研结果，通过数万例数据的分析发现中国人群中吡哆醇依赖性癫痫的携带率高达1/66[7]。而之前这一疾病的发病率在临床被严重低估。2015年，华大基因与欧洲最大辅助生殖中心Igenomix进行的623种隐性遗传病携带者筛查研究表明，约84%(2161/2570)样本携带至少一个致病突变；约5%(7/138)准备接受辅助生殖手术的夫妇检出携带有同一遗传病的致病基因突变；2%(6/287)女性受检者检出有X连锁遗传病的致病突变[10]。

导致隐性遗传病发生率不断升高的原因很多。研究数据表明，人群中约85%的个体可能是严重遗传疾病的携带者，个体可携带隐性遗传致病基因2～5个[11]，因此人类有较高的“遗传负荷”，虽然携带者无疾病表型，但通过遗传物质的组合和交换，将严重致病基因遗传后代，使其具有患病的风险。随着环境污染和人类生育方式的改变，基因的突变率也必将增加，而突变大多数是隐性的，这也将进一步提高人群的“遗传负荷”，从而加重遗传病对后代的危害。这些遗传病给患者及其家庭带来沉重的经济、精神和社会负担，已经成为严重影响我国出生人口质量和儿童健康的重要障碍。在孤儿药和罕见病治疗技术研发严重滞后的当前，患者也往往面临“无药可治”“有药治不起”“治起买不到”的局面。因此最根本的解决方案是在源头对疾病进行防控，减少出生缺陷的发生。

2 扩展性携带者筛查技术

携带者筛查是指通过在孕前或孕早期识别出携带有常染色体或X连锁隐性遗传病。近年来，多项国内外研究表明孕前针对高携带率隐性遗传病的携带者筛查是阻止出生缺陷的重要一级预防措施，这一策略使得特定的遗传疾病在高危人群中的发病率显著下降。传统的携带者筛查重点筛查种族高发疾病[12]，如1971年在德系犹太人中开展的Tay-Sachs病筛查，使其发病率降低90%[13]。随着高通量测序技术的发展和应用，扩展了筛查病种，使得特定人群以及更多没有家族史的普通人群能在孕前/产前进行多种疾病的筛查，也称ECS[14]。2011年，Bell等[11]首次报道了采用高通量测序技术进行遗传病携带者筛查，通过对104例无关个体进行448种儿童期严重隐性遗传病筛查，发现人均携带2.8个致病突变。至此开启ECS技术在临床的应用。

高通量测序技术又称新一代测序技术(next generation sequencing，NGS)，允许对数以百万计的不同DNA片段混合物进行并行的深度测序，具有通量高、信息量大和敏感度高的特点，为个性化的诊断和治疗带来了巨大的突破，尤其是单基因遗传病相关领域[15-16]。高通量测序DNA水平的应用通常分为全基因组测序、全外显子组测序及目标基因测序。全基因组测序是获得人类整个基因组信息，包括编码区和非编码区序列，可以获得大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、拷贝数变异(CNV)、插入缺失(InDel)、结构变异(SV)等变异信息，是最全面的基因组分析手段，但如何面对产生的海量数据以及如何从中分析到真正与临床和科研工作相关的信息并进行有效的转化是目前最大的难题；外显子是基因行使其功能最直接的体现，全外显子组占全基因组的2%左右，外显子组测序则是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，得到的信息大多是与蛋白质功能变异相关的遗传突变，更直接、更便捷地帮助临床与科研工作；目标序列捕获测序是将特定基因组区域定制成特异性探针与检测样本基因组DNA进行杂交，将目标区域的DNA片段进行富集后再利用高通量测序技术进行测序的策略，可以低成本、快速地检测相关基因，进而提升检测效率。

就单基因遗传病来讲，目标序列捕获测序技术相对经济实惠，针对疾病目标基因设计富集探针，针对性地检测疾病致病基因位点的同时，降低了测序成本和检测周期，为孕早期孕妇行产前诊断留出宝贵的时间[17]。

3 扩展性携带者病种选择和基因包

2017年ACOG先后发布了两个委员会意见(No.690，No.691)[1-2]。针对ECS制订了标准共识，临床检测疾病、检测对象和遗传咨询意见。《基因组医学时代的基因携带者筛查》(No.690)对携带者筛查基因包中包括的疾病，提出应符合以下几点标准[1]：1)携带频率≥1%；2)有定义明确的表型；3)严重影响生活质量，造成认知和躯体损害，需要手术或医疗干预；4)在生命早期发病；5)疾病可产前诊断，得以产前干预而改善围生结局；可制订个体化分娩管理措施，以改善新生儿和婴儿的结局；对父母进行产后特殊护理的培训；6)不应包含成人发病的疾病。在《遗传病携带者筛查》(No.691)指南对受检对象提出指导意见[2]：1)应为每一名孕妇提供遗传病携带筛查的相关信息；2)携带者筛查和咨询最好在怀孕前进行；3)如果受检者发现为某种疾病的携带者，受检者的配偶应该进行相关检测以便了解夫妻生育患儿风险的信息，进行遗传咨询；4)建议夫妻双方同时筛查，以保证有充裕的时间进行产前诊断；5)有某种遗传病家族史的受检者应该提供针对该种疾病的携带者筛查，并进行遗传咨询；6)产前携带者筛查不能替代新生儿筛查，而新生儿筛查也不能取代产前携带者筛查的价值；7)如果受检者要求对某种特殊疾病进行携带者筛查，而这种疾病可以通过现有检测技术实现且合理，考虑其种族和家族遗传史，经过遗传咨询该检测的风险、获益和局限性后，可为受检者提供该检测。

2017年8月，ACOG委员会发表《找寻构建临床有效的扩展性携带者筛查Panel的中间地带》评论，提出了扩展性携带者筛查基因Panel的具体标准，并选出符合筛查标准的96种疾病[18]。2018年有文章总结了34篇关于ECS的报道，Panel包含病种41～1792种，包含基因40～1556种，其中只有3种隐性疾病同时包含在16种Panel中[19]。这说明ECS病种选择需要基于特定的人群和疾病发生率。

2017年，美国Counsyl公司的Beauchamp通过474644个ECS受检者数据，分析携带率及聚集性，对检测基因及相应的检测方法进行了系统优化[20]。2019年，Guo和Gregg[21]收集Gnom AD数据库中123136个外显子的数据，针对415例严重隐性遗传疾病开展相关基因在不同人群中携带率的研究，发现32.6%(东亚)～62.9%(德系犹太人)的个体是至少一个基因的变异携带者，而对于夫妇来说，将有0.17%～2.52%的夫妇有可能生育疾病后代，仅筛选携带者率大于1.0%的40个基因就能识别出76%以上的高危夫妇。这两项研究为筛选适合不同种族人群ECS覆盖的疾病和基因，提供了一定的参考。

目前，基于中国人群的ECS数据比较有限。2019年Zhao等[22]对中国34个种族的10476对产前/受孕夫妇进行了12个基因(包含11种孟德尔疾病)的携带者筛查，结果表明多疾病携带者筛查可替代传统的单病种筛查，主张扩大筛查病种。Xi等[23]对1462对(2923人)需要进行辅助生殖的夫妇开展了202个基因(121个常染色体隐性疾病和14个X连锁疾病)的ECS检测，结果表明ECS对于辅助生殖具有重要的临床效用，其数据也为中国人群ECS基因Panel选择提供了一些启示。

2020年澳大利亚的一项10000对夫妇的ECS研究，提出基因Panel选择标准应是儿童期致死或致残疾病，和(或)早期诊断和干预将大大改变疾病预后，同时有强有力的基因表型关系证据[24]。ECS基因Panel的选择是一个动态过程，需要不断进行审查和完善。同年，Kristjan等[25]对93419个来自不同种族的个体进行96个基因的ECS检测，Westemeyer等[26]对381014个体进行了274个基因的ESC数据分析，两篇研究均提出，针对种族和家族史的传统携带者筛查设计不足以满足日益多样化的多元文化群体，多病种同时筛查的ECS临床应用将成为出生一级防控重要手段。

4 扩展性携带者筛查的临床应用策略

随着ECS在临床的需求日渐强烈，在出生缺陷一级防控中如何正确规范应用ECS被提上日程。ACMG、ACOG、美国围产儿保护基金会(PQF)、美国遗传咨询协会(NSGC)、美国母胎医学协会(SMFM)、加拿大医学遗传学学院(SOMCCCMG)、皇家学院妇产科(RCOG)、国际产前诊断学会(ISPD)等多个专业学术组织先后发表关于高通量测序技术在孕前/产前进行遗传病携带者筛查的指南和声明建议[4,27]，肯定了扩展性携带者筛查的意义，对遗传咨询和临床应用等提出指导意见。

检测前需要知情告知，使患者了解检测技术优点和局限性；检测后需要遗传咨询，针对检测结果做出解读。大多数情况下，ECS仅报告已知明确的致病(P)和可能致病位点(LP)，而对不确定位点(VUS)的报告比较谨慎，除非其同时携带P或LP位点[23]。一方面，告知患者其携带VUS可能会产生不必要的焦虑，因为大多数VUS最终被确定为非疾病引起的[10]。另一方面，VUS不能被完全忽略，因为其中一些具有致病性，尤其在夫妻双方同时携带的情况下，需要遗传咨询师对各种证据进行评估后进行报告和咨询。早孕期ECS筛查对于医疗机构而言，后续的遗传咨询和产前诊断要求较高，压力较大。

目前，ECS技术临床应用策略主要包括针对普通备孕人群的筛查、针对具有生育风险(如有家族史)人群的筛查以及针对不孕不育人群的筛查。国际上报道的ECS研究多集中与普通备孕人群和不孕不育人群。在我国，目前尚缺乏针对不同分层人群的系统研究，因此难以评判ECS临床应用的最适宜策略。

在临床实际应用中，针对接受筛查夫妻的检测方案、检测时间、后期对检测结果的遗传咨询和辅助生殖方案的设计，是当前决定ECS是否能够在临床落实和推广应用的关键。同时ECS还受检测时效性、卫生经济学、伦理等诸多因素的影响。

ECS不仅需要临床医师和遗传学家的参与，也同样需要政府、政策、医疗救治以及社会救助的支持。2020年，Singer和Sagi-Dain[28]报道了以色列2015-2017年国家卫生部组织的18个基因的携带者筛查，筛查例数919820，数据显示，在政府的支持下，几年后携带者筛查确实有效降低了以色列出生缺陷率，如囊性纤维化疾病从1990年的14.9%降低至6%等。Shen等[29]在文章中建议，在国内ECS的应用过程中，为了降低风险，提高获益率，应该广泛联合政府、医学遗传学相关学会、医学相关学会、医疗机构以及社会救助机构的力量，建立ECS工作组，使得这项工作系统化和规范化。因此，ECS临床的实际应用可以通过综合考量政策支持、本地医疗机构的医疗过程、医疗技术等因素后得出最适宜的方案。