环状RNA在胰腺癌中的研究进展

王砚伟，梁雨荣

解放军总医院 肝胆胰外科医学部，解放军总医院肝胆外科研究所，全军数字肝胆外科重点实验室，北京 100853

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人类恶性程度最高的肿瘤之一[1]。其最主要的病理类型是导管腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，约占85%[2]。胰腺癌具有高度的侵袭性，以病死率高、预后差为特点，中位生存期为3～6个月，目前5年总生存率为8%左右[3-4]。胰腺癌仅占所有癌症发病数的2%，但却占癌症相关死亡人数的5%，在无症状癌症中居于首位[5]。近年来，其发病率逐渐上升，根据西方国家的统计，预计到2030年，胰腺癌将超过乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌，成为仅次于肺癌的第二大癌症相关死亡原因[6]。目前中国每年的胰腺癌新发病例数和死亡人数均已经超过了美国，胰腺癌的健康负担逐年增加[3]。现阶段手术切除仍是胰腺癌最有效的治疗措施[7]。然而，由于胰腺癌早期症状并无特异性，同时又缺乏有效的筛查策略，仅15%～20%的患者能够接受手术切除，其余80%～85%的患者在发现时即为转移性或局部晚期而失去手术机会，因此寻找一种行之有效的早期诊断方法和靶向治疗策略是当下的迫切需求[8]。随着基因芯片和RNA测序技术(RNA-seq)的发展，研究发现大量环状RNA(circular RNA，circRNA)在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中表达异常，并且通过调控下游靶分子如微小RNA(micro RNA，miRNA)或RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)参与胰腺癌的发生、发展、耐药、自噬及免疫逃逸，并与肿瘤TNM分期及患者的预后相关，有潜力成为胰腺癌诊断和治疗的靶点，为胰腺癌的诊治带来了希望[9]。本文对胰腺癌组织中异常表达的circRNA展开讨论，总结了其生物学特性和作用机制，并对其应用前景进行了探讨。

1 circRNA的结构和功能

共价闭合circRNA最初在植物类病毒、酵母线粒体和D型肝炎病毒中被发现，一度被认为是错误剪接的产物，直到近些年其重要性才逐渐被发现并深入研究[10]。circRNA是一类长度为200～2 000 bp的特殊非编码RNA分子，属于长链非编码 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的一种[11]。不同于典型的线性RNA，circRNA是信使RNA(messenger RNA，mRNA)前体反向剪接并由共价键连接的封闭环状结构[12]。根据其来源不同，可分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA以及基因间circRNA，其中外显子来源的circRNA占绝大多数[9]。由于circRNA分子是封闭的环状结构，不具备5′端帽子和3′端poly(A)尾，因而不易被RNA酶水解，具有十分稳定的结构，可以广泛存在于外泌体和血浆中，具有高度的保守性和组织特异性[13-14]。

circRNA的生物学功能：1)作为miRNA海绵(sponge)。由于circRNA含有丰富的miRNA结合位点，可以充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，吸附miRNA, 抑制其与下游靶基因的结合，从而间接地调节靶基因的表达水平[15]。2)与RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)相互作用。一些circRNA可以与RBP结合形成RNA-蛋白复合物，如circ-Foxo3和circ-MBL，circ-Foxo3能够与多种类型的蛋白质结合，通过与CDK2、P21相互作用抑制细胞周期，阻断细胞从G1期向S期的过渡，调控细胞的增殖[9]。3)调节基因转录。有研究发现，一部分定位于细胞核中的circRNA，如circ-EIF3J和circ-PAIP2，可以与抗U1小核糖核蛋白抗体(U1 snRNP)结合，进一步与RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)相互作用，上调其亲本基因的表达[16]。4)蛋白质翻译。有研究报道显示，少数环状RNA具有翻译成蛋白质的潜力，如circ-ZNF609在内部核糖体进入位点(IRES)的驱动下，可以翻译小鼠成肌细胞中的蛋白，这对circRNA是非编码RNA的传统观念提出了质疑[17]。

2 胰腺癌领域相关的circRNA

2.1 circNFIB1 circNFIB1在circBase中的代码为hsa_circ_0086375，定位于chr9：14146687-14155892。由于其来源于核因子I/B(NFIB)基因位点的第16～18外显子，因此被命名为circNFIB1[18]。Kong等[18]分析了160例胰腺癌标本的circNFIB1表达，发现淋巴结转移和高TMN分期的患者circNFIB1表达水平较低；qRT-PCR分析显示，与配对的原发灶相比，淋巴结转移瘤细胞中的circNFIB1水平更低，提示circNFIB1表达水平与淋巴转移呈负相关。在进一步的体外实验中，利用siRNAs沉默circNFIB1，与对照组相比，人淋巴管内皮细胞的管腔形成和迁移能力明显增强；Transwell实验也表明，circNFIB1基因沉默促进了PANC-1、CAPAN-2和SW1990细胞的迁移能力；以上结果表明circNFIB1抑制了胰腺癌细胞的转移[18]。荧光原位杂交技术(FISH)和亚细胞分离实验表明，circNFIB1主要位于细胞质中，细胞质定位的circRNA主要作为ceRNA发挥作用，并参与转录后调控[18]。Pull-down实验表明，在Capan-2和PANC-1细胞中，miR486-5p被circNFIB1富集；荧光素酶报告实验表明，与对照组相比，miR-486-5p过表达显著降低了circNFIB1的荧光素酶活性；FISH分析也证实了circNFIB1和miR-486-5p在肿瘤细胞胞质中的共同定位，均提示circNFIB1靶向miR-486-5p发挥抑瘤作用[18]。进一步研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)与miR-486-5p存在互补序列，二者在PDAC细胞中呈负性共表达[18]。PIK3R1是PI3K的受体单位，此前有报道称其抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而抑制肿瘤进展[19]。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是淋巴管生成所必需的，前期研究表明VEGF-C是PI3K/Akt信号通路的下游调节因子，qRT-PCR分析显示，胰腺癌细胞中VEGF-C的表达水平在circNFIB1被沉默后增加[18]。综上，circNFIB1可通过海绵作用吸附miR-486-5p，进而上调PIK3R1的表达水平，抑制PI3K/Akt通路，进一步下调VEGF-C的表达，抑制肿瘤淋巴转移[18]。

2.2 Hsa_circ_100 782 circRNA_100782定 位于chr11：33307958-33309057，序列长度为1 099 nt[20]。Chen等[20]通过qRT-PCR研究了circRNA_100782在正常胰腺上皮细胞系(human pancreatic duct epithelial cells，HPDE)和BxPC3细胞系之间的表达，发现其在BxPC3细胞中显著高表达。在随后的基因敲除实验中，利用siRNA沉默circRNA_100782，CCK-8和集落形成实验表明circRNA_100782敲除BxPC3细胞系的增殖和集落形成能力显著减弱，表明circRNA_100782是肿瘤细胞增殖的正向调节因子[20]。通过TargetScan数据库推测miR-124具有circRNA_100782的结合位点[20]，既往有研究表明，miR-124通过靶向白细胞介素6受体(interleukin-6 receptor，IL6R)和信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在食管癌、肝细胞癌和胰腺癌等多种癌症中发挥抗肿瘤效应[21]。Western blot结果表明，IL6-JAK2-STAT3信号通路与胰腺癌的细胞增殖有关，STAT3主要受上游IL6R的调控，IL6R的激活促进下游非受体型酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)蛋白磷酸化，磷酸化的JAK2蛋白进一步活化下游STAT3，增强了细胞增殖能力，促进肿瘤的发生和转移[20]。前期研究发现，miR-124通过直接靶向IL6R和STAT3的3’-UTR发挥作用，过表达的miR-124可显著下调IL6R、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达水平，进而抑制肿瘤增殖[21]。以上研究证实circRNA_100782能够与miR-124结合并抑制其活性，进而激活IL6R和STAT3，促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。

2.3 circ_0030235 circ_0030235定 位 于chr13:49075877e49077050，基因符号为RCBTB2[22]。高通量circRNA微阵列结果显示，与配对的非癌组织相比，circ_0030235在胰腺癌组织样本中过表达[23]。Xu等[22]的研究表明，circ_0030235的表达水平与肿瘤分期(P=0.001)、淋巴结浸润(P=0.013)呈正相关，与患者的长期预后呈负相关(P=0.010)[22]。CCK-8实验、集落形成实验以及流式细胞仪检测结果表明，circ_0030235被沉默后，PANC1细胞系的增殖和集落形成能力显著下降，凋亡明显增多[22]。进一步研究表明，circ_0030235通过靶向miR-1253和miR-1294发挥促癌作用。在此前的研究中，miR-1253和miR-1294已被验证在多种癌症中发挥肿瘤抑制效应[22]。Liu等[24]研究发现miR-1253通过靶向Wnt5A抑制非小细胞肺癌的生长和侵袭。Shi等[25]研究报道了miR-1294在胃癌组织中的表达明显低于相邻正常组织，且其表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移和远处转移等临床病理参数相关。Wang等[26]发现miR-1294通过靶向c-Myc抑制口腔鳞状细胞癌的增殖和转移。综上，circ_0030235作为miR-1253和miR-1294的分子海绵，下调二者在肿瘤组织中表达水平，减弱其抑癌效应，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

2.4 circRNA_000864 circRNA_000864在circBase中的代码为hsa_circ_0000662，基因定位于chr16：398402-398484，基因组长度为82 nt。Huang等[27]通过RT-qPCR检测了circRNA_000864在59例胰腺癌组织及配对的癌旁正常组织中的表达，结果显示，circRNA_000864在胰腺癌组织中的表达低于癌旁正常组织(P＜ 0.05)，且与TMN分期有关。为了进一步评估circRNA_000864是否影响胰腺癌细胞的生物学功能，用oe-circRNA_000864质粒转染AsPC-1细胞，使circRNA_000864表达增加，随后的Transwell、流式细胞检测显示，实验组细胞增殖、迁移和侵袭能力下降，凋亡增加[27]。circInteractome数据库预测circRNA_000864与miR-361-3p之间存在结合位点，双荧光素酶报告实验进一步验证了二者的靶向关系[27]。EDU试验、Transwell试验和流式细胞仪检测显示，用miR-361-3p模拟物转染ASPC-1细胞系后，阻滞于G0/G1期的细胞比例下降，S期细胞的比例上升，细胞迁移和侵袭增多，凋亡减少，而oecircRNA_000864转染可逆转这些效应[27]。TargetScan数据库预测显示miR-361-3p在胰腺癌细胞中与B细胞异位基因2(B-cell translocation gene 2，BTG2)有结合位点，可以与BTG2的3’-UTR区特异性结合[27]。在既往研究中，BTG2被认为是一种肿瘤抑制基因，Huang等[28]报道过表达的BTG2可显著抑制肝癌细胞的增殖和集落形成能力，提高肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感度；Zhou等[29]研究发现BTG2是miR-27a-3p在胃癌中的直接作用靶点，过表达的BTG2可触发细胞G1/S期阻滞，诱导凋亡。

2.5 circ-ASH2L Chen等[30]通过对25组胰腺癌组织和癌旁正常组织进行qRT-PCR分析发现，circ-ASH2L在胰腺癌组织中的表达增高，并且与淋巴浸润、TNM分期和远期生存率显著相关。CCK-8和Transwell试验表明，在胰腺癌细胞系Capan-1及AsPC-1中上调circ-ASH2L的表达可促进其增殖和侵袭；流式细胞仪分析显示，在AsPC-1细胞中过表达circ-ASH2L后，停滞在G1期的细胞减少，在Capan-1细胞中，沉默circ-ASH2L可使更多的细胞被阻滞在G1期[30]。为了进一步检测circ-ASH2L在血管生成中的作用，用circ-ASH2L转染人脐静脉内皮细胞，与对照组相比，其管状结构的生成明显增多[30]。使用miRanda工具对circ-ASH2L的潜在靶点进行预测，并进行了qRTPCR分析，结果表明miR-34a是circ-ASH2L最可能的作用靶点，随后的生物信息学分析和双荧光素酶报告实验也证明了这一点[30]。已有研究报道miR-34a可以通过调节Notch1的表达，作用于P21、c-MET、SNAIL和VEGF信号通路调节细胞周期，促进包括乳腺癌、胰腺癌在内的多种肿瘤的增殖、侵袭、迁移和血管生成[31-32]。Western blot实验表明，circ-ASH2L可以上调Capan-1和AsPC-1细胞Notch1的表达，而miR-34a可降低Notch1的表达，并且miR-34a所介导的抑制作用可以被circ-ASH2L所逆转[30]。因此，circ-ASH2L通过作为miR-34a的ceRNA，靶向Notch1通路，调节P21、c-MET、SNAIL和VEGF的表达，最终促进肿瘤的增殖、侵袭和血管生成。

2.6 circ-ADAM9 Xing等[33]研究表明丝氨酸蛋白酶3(serine protease 3，PRSS3)在胰腺癌细胞系和组织中的表达显著增加，并与肿瘤的侵袭性呈正相关。通过对Targetscan和miRanda数据库的分析发现PRSS3的3’-UTR与miR-217之间存在互补序列，荧光素酶报告基因检测表明，miR-217过表达显著降低了野生型载体的荧光素酶活性，但对突变型载体的荧光素酶活性没有影响，验证了PRSS3 3’-UTR中的“UGCAGU”序列是miR-217针对PRSS3的作用位点[33]。与邻近正常组织相比，miR-217在胰腺癌组织中的表达显著下调，并且与临床分期、淋巴结转移以及预后相关，提示miR-217是肿瘤发生过程中一个重要的异常miRNA，其下调可能是导致PRSS3过表达的原因之一[33]。在进一步的实验中，miR-217的敲除增加了PC细胞中PRSS3的表达，miR-217沉默的MiaPaca2细胞系表现出较对照细胞更强的增殖、迁移和侵袭能力，并且这些效应随着PRSS3基因敲除而减弱[33]。RNA Pull-down分析和荧光素酶报告实验表明circ-ADAM9与miR-217关系密切，在胰腺癌组织中circ-ADAM9的表达明显高于匹配的非癌组织，且与TNM分期、淋巴结转移以及预后相关[33]。qRT-PCR和Western blot结果显示，circ-ADAM9的过表达显著提高了PRSS3的表达水平，并且这种现象可被miR-217的表达所抑制；相反，circ-ADAM9的敲除显著降低了PRSS3的表达，而miR-217的缺失可以挽救这一现象[33]。此前已有研究表明PRSS3是一种促癌基因，能够通过激活ERK/VEGF通路促进胰腺癌细胞的增殖和转移[34]。

2.7 circBFAR circBFAR在circBase中的代码为hsa_circ_0009065，序列长度为336 nt，由于其来源于BFAR基因外显子2，被命名为称为circBFAR[35]。Guo等[35]通过对6对胰腺癌样本和匹配的癌旁正常组织样本进行微阵列分析，筛选出了20个可能存在异常表达的circRNA，之后在含有208例PDAC患者的队列中进行进一步验证，发现只有circBFAR的表达差异有统计学意义。集落形成实验和Transwell实验表明，circBFAR能促进体外肿瘤细胞的增殖和迁移；体内实验表明，与对照组裸鼠相比，circBFAR基因敲除的裸鼠肿瘤重量和体积更小，Ki-67水平较低[35]。Pull-down实验和荧光素酶报告实验均表明miR-34b-5p是PANC-1和BxPC-3细胞中唯一与circBFAR特异性结合的miRNA，qRT-PCR分析也进一步证实，胰腺癌组织中miR-34b-5p的表达明显低于癌旁正常组织，且与TNM分期呈负相关[35]。进一步的研究表明，胰腺癌细胞中miR-34b-5p过表达和circBFAR敲低均显著下调了间充质-上皮转化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)的表达[35]。MET被认为是一种关键的酪氨酸激酶，在细胞增殖过程中发挥着重要作用，既往有研究表明，MET在胰腺癌细胞中过表达，对肿瘤的发生和发展起促进作用[36]。Western blot结果表明，miR-34b-5p的过表达或circBFAR的敲除都显著降低了MET及其下游信号转导蛋白磷酸化Akt(蛋白激酶B，PKB)的水平(Ser 473)，而对总Akt的水平无明显影响[35]。因此，circBFAR通过作为miR-34b-5p的分子海绵，异常激活MET/Akt通路，进而促进胰腺癌细胞的增殖和转移。

2.8 circSFMBT1 circSFMBT1在circBase中的代码为hsa_circ_0066147，序列长度为234 bp，来源于SFMBT1基因第9~10外显子[37]。Xu等[37]通过对32例胰腺肿瘤标本和邻近非肿瘤对照标本进行qRT-PCR分析发现，肿瘤样本中的circSFMBT1和P21-激活激酶1(PAK1)水平显著上调，而miR-330-5p水平下调，同样的结果在4个胰腺癌细胞系(PANC-1、AsPC-1、Capan1和BxPC-3)和HPDE中得到了印证。生物信息学分析(基于CircInteractome数据库)和双荧光素酶报告实验表明circSFMBT1和miR-330-5p之间存在互补的结合位点[37]。以sh-circSFMBT1转染胰腺癌细胞进行基因敲除，结果表明，与转染shNC的对照组相比，实验组细胞miR-330-5p的表达水平升高，细胞形成的集落数目减少，凋亡百分率升高，同时，Western blot结果显示，敲除circSFMBT1显著降低了胰腺癌细胞中增殖相关蛋白的水平，包括CyclinD1、c-Myc、Ki-67和Bcl-2，上调了凋亡相关蛋白的水平，如Bax[37]。进一步的研究表明，miR-330-5p在PC细胞中的表达显著降低了PAK1的表达水平，通过生物信息学分析，初步确定了miR-330-5p和PAK1 mRNA之间存在互补的结合位点，双荧光素酶报告实验则直接证实了二者的相互作用[37]。PAK1是丝-苏氨酸激酶家族的成员之一，在调节细胞骨架重构等生物学过程中起着关键作用，先前的研究表明PAK1能够促进上皮-间充质转化，进而导致肿瘤的进展和转移，PAK1通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)和MET促进乳腺癌的恶性转变[38]。综上，circSFMBT1作为miR-330-5p的分子海绵，下调miR-330-5p的表达，解除了其对PAK1信号通路的抑制，最终激活MAPK和MET，从而促进了胰腺癌的增殖、进展和转移。

2.9 circEIF6 circEIF6又被称为circRNA真核起始因子6，在circBase中的代码为hsa_circ_0060055[39]。Zhang等[39]通过对39例胰腺肿瘤组织及与之配对的癌旁正常组织进行qRT-PCR分析发现，在胰腺癌组织中circEIF6的表达显著增强，且与TNM分期呈正相关，在诊断实验中ROC曲线下面积(AUC)为0.909 3(95% CI：0.845～0.973 5)，表明circEIF6对于胰腺癌具有一定的诊断价值[39]。在基因敲除实验中，用siRNA沉默circEIF6，结果表明，与转染si-NC的对照组细胞相比，实验组细胞增殖能力减弱，迁移和侵袭能力也受到明显抑制，细胞凋亡增加[39]。生物信息学检测和荧光素酶报告实验表明circEIF6与miR-557之间存在相互作用的靶点[39]。根据之前的报道，miR-557可以抑制胰腺癌和肺癌的发展。Yang等[40]的研究证明miR-557过表达通过靶向表皮生长因子受体抑制了胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。Zhang等[39]的研究表明，miR-557沉默可逆转由于circEIF6敲除所导致的肿瘤细胞增殖抑制，细胞的迁移和侵袭能力也提高，细胞凋亡减少。qRT-PCR和荧光素酶报告实验提示miR-557与溶质载体家族7成员11(SLC7A11)存在相互作用的靶点，在胰腺肿瘤组织中SLC7A11的表达高于癌旁正常组织，并且在两种胰腺癌细胞系(Hs 766T和SW1990)中SLC7A11的表达水平也明显高于HPDE，与miR-557的表达呈负相关，与circEIF6的表达呈正相关[39]。miR-557过表达可显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而SLC7A11转染可减弱这些抑制作用，减少肿瘤细胞凋亡[39]。进一步的研究表明，miR-557过表达下调胰腺癌细胞中磷酸化蛋白激酶B(PKB，Akt)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的水平，而导入SLC7A11质粒后，胰腺癌细胞中p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K水平基本恢复，提示miR-557通过靶向SLC7A11抑制了PI3K/Akt通路的活性和恶性潜能[39]。

3 结论

尽管目前用于胰腺癌诊断和治疗的circRNA还处于研究起步阶段，但已经取得了一些初步的进展，已有研究证实胰腺癌组织与癌旁组织的circRNAs的表达谱有显著差异。进一步研究表明，胰腺癌中的circRNAs可以通过与miRNAs结合，作用于不同的信号轴，调节肿瘤细胞的侵袭、转移、免疫逃逸和化疗耐药等行为，识别这些信号通路可能为胰腺癌的治疗提供新的靶点。然而，目前尚缺乏强有力的动物实验和临床研究证据证实circRNAs在临床诊断和治疗中的确切作用，且circRNA在胰腺癌的发生和进展中的作用机制还有待进一步研究。鉴于circRNA的独特优势和广泛功能，笔者认为circRNA在胰腺癌的早期诊断和靶向治疗方面具有广阔的应用前景。