高毒力肺炎克雷伯菌毒力和耐药机制研究进展

蒋玉婷，张 珂，刘唐娟，黄莹莹，温中薇，孔晋亮，陈一强

(广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西 南宁 530021)

肺炎克雷伯菌是常见的革兰阴性杆菌，尤其在免疫力低下患者中，是最常见的机会性致病菌之一。根据毒力特点可将肺炎克雷伯菌分为普通型肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKp)。cKp通常在免疫力低下患者中致病，引起医院获得性感染。而hvKp通常在健康人群中引起社区获得性感染，糖尿病和消化系统疾病患者更易感染[1]，且常伴随多部位侵袭性感染，如化脓性肝脓肿、脑膜炎、眼内炎、骨髓炎、脾脓肿和坏死性筋膜炎等，较cKp更具毒性，因此被称为hvKp[2-3]。起初，人们以高黏液黏度表型定义hvKp，但越来越多研究发现，并不是所有hvKp菌株都具有高黏液黏度表型[4]。Zhang等[5]建议hvKp应由关键毒力基因型而不是高黏液黏度表型进行定义，并认为仅通过检测高黏液黏度表型的拉丝试验定义hvKp可能会使研究结果产生偏颇，特别是在小样本量的研究中。Harada等[6]也指出拉丝试验性能较差，准确率仅为90%，而rmpA、rmpA2、peg-344、iroB和iucA等毒力基因，以及铁载体定量测定≥30 μg/mL，准确率>95%，可作为准确区分hvKp与cKp的生物标志物。因此，人们逐渐结合关键毒力基因型定义hvKp，如采用rmpA和iucA基因阳性，rmpA、iucA和iroB基因阳性，高黏液黏度表型、rmpA基因阳性和K1/K2，高黏液黏度表型、rmpA/rmpA2和magA基因阳性(尤其适用于K1 ST23 hvKp)等组合定义hvKp[7-10]。但至今还未有hvKp定义的国际共识，仍需继续探索hvKp的最佳定义标准，以期能尽早发现hvKp菌株，便于临床预防和治疗。另外，hvKp菌株可获得单种或多种耐药基因，如碳青霉烯酶基因、广谱β-内酰胺酶基因、粘菌素抗性相关基因、磺酰胺抗性基因(sul1、sul2和sul3)及甲氧苄啶抗性基因(dfrA1和dfrA12)等，表明部分hvKp菌株已经进化成既有高毒力表型又有耐药表型的“超级细菌”[11-12]。高毒力和耐药共存的肺炎克雷伯菌近期已增加了约50%[13]，并在多地医院引起感染暴发，导致极高病死率[12, 14]。hvKp耐药株已经出现并越来越多，可能导致严重甚至无法治疗的感染，对公众健康造成极大威胁，因此本文对hvKp菌株的毒力因子和耐药机制研究进展进行综述。

1 hvKp流行病学

1986年Liu等[15]首次提及hvKp，发现7例来自中国台湾的肺炎克雷伯菌化脓性肝脓肿患者均合并眼内炎，且同时合并心内膜炎、脑膜炎、肺炎或肾炎之一，此是一种不同于cKp的侵袭性感染。随后，在韩国、越南及中国出现许多相似报道[16]。中国台湾研究[17]显示，肺炎克雷伯菌分离株中，hvKp菌株占54.3%(150/276)。韩国37.4%(155/414)的肺炎克雷伯菌具有高黏液黏度表型[18]。中国大陆研究[19]显示，230株肺炎克雷伯菌分离株中37.8%为hvKp，且hvKp的检出率在不同城市之间存在差异，武汉高达73.9%，而浙江仅8.3%。肺炎克雷伯菌引起的社区获得性肝脓肿占所有化脓性肝脓肿病例的80%，而引起化脓性肝脓肿的病原体中90.9%是hvKp菌株[20]。hvKp成为了亚洲化脓性肝脓肿最常见的原因，并开始在全球播散。21世纪以来，法国、日本、伊朗、美国、埃及、西班牙、英国、加拿大、澳大利亚、印度和新加坡等国家也逐渐出现hvKp相关报道，但检出率并不高(3.2%～20.3%)[21-24]。然而近几年，新的hvKp菌株—耐药hvKp开始在临床出现，其表现出高毒力和难治愈性再度引起人们关注。一份来自温州某医院的报告[14]显示，2017年3月—2018年1月，该院重症监护病房耐碳青霉烯类hvKp暴发，导致病死率100%(8/8)。类似的报道也曾在中国杭州以及伊朗等地出现[12, 25]。hvKp和耐药hvKp正在威胁着人类健康，必须加强对hvKp的认知及管控。

2 hvKp相关毒力因子

较cKp菌株而言，hvKp菌株对中性粒细胞和补体介导的吞噬作用以及中性粒细胞胞外杀菌作用具有更强的抵抗力[26]。体外试验[24]也表明，hvKp菌株具有更强的生存能力，且在各种感染模式中表现出更强的毒力。在hvKp菌株中，存在多种与其高毒力相关的因子，主要包括荚膜多糖、序列类型、毒力质粒、整合性接合元件(integrative conjugative elements，ICEs)、铁载体等。

2.1 荚膜多糖 荚膜多糖由直链或支链低聚糖组成，其包裹在肺炎克雷伯菌周围形成一个保护屏障，使肺炎克雷伯菌能在劣势环境(如干燥环境、宿主免疫吞噬、抗菌药物攻击等)中生存。hvKp菌株的荚膜多糖受黏液表型调节基因rmpA/rmpA2、rmpC和magA(wzy-k1)的正调控[10, 27]。根据K抗原血清学检测，荚膜多糖至少可分为78种类型[28]，K1、K2、K5、K20、K54和K57是hvKp菌株最普遍的血清型。其中K1血清型与ST23密切相关，常引起化脓性肝脓肿，在亚洲占主导地位。而K2血清型在遗传上呈多样化，在美国和欧洲更常见，K2血清型的ST65 hvKp菌株与各种侵袭性感染相关[3, 29]。值得注意的是，K1、K2、K5和K57型荚膜多糖缺乏巨噬细胞凝集素受体识别的甘露糖或鼠李糖，能逃避凝集素吞噬和巨噬细胞杀伤，为hvKp存活和繁殖创造了良好环境[26]。荚膜多糖的厚度决定了其对肺炎克雷伯菌的保护程度[30]，而hvKp菌株常伴随较cKp更丰富的荚膜多糖，因此，hvKp菌株更能抵抗各种体液防御(如补体杀伤、人β-防御素)和抗微生物肽(如中性粒细胞蛋白1和乳铁蛋白)，有助于其在宿主体内播散并产生耐药性[31]。

2.2 序列类型 多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，可将细菌分为不同的序列类型(sequence type，ST)，并确定不同序列类型间的关系以及与疾病的联系。经MLST分析发现，大多数hvKp菌株都是经克隆扩增的，其核心基因组变异有限且毒力基因高度保守，克隆群CG23与hvKp菌株的高毒力表型密切相关[29]。在亚洲流行的hvKp菌株中，37%～64%的分离株为克隆群CG23，包括ST23、ST26、ST57和ST163。ST23是hvKp菌株中最普遍的序列类型，并与K1血清型和肝脓肿密切相关[3]；而ST65、ST66、ST86、ST373、ST374、ST375、ST380和ST434与K2相关，其中又以ST65(42%)和ST86(46%)更常见[32]。据不完全统计，2015—2017年中国鉴定的47株耐碳青霉烯类的hvKp分离株，其序列类型分布为 ST11(26株)、ST65(7株)、ST23(5株)、ST1797(3株)、ST268(2株)以及ST25、ST595、ST692和ST1700(各1株)[29,33]，表明我国耐碳青霉烯类的hvKp菌株以ST11为主。中国耐碳青霉烯类cKp以ST11常见，hvKp多见于ST23[34]，提示ST23 hvKp菌株和ST11 cKp耐药株间存在相互作用，即ST23 hvKp和ST11耐碳青霉烯类cKp间已出现毒力和耐药相关遗传物质的交换。

2.3 毒力质粒 与cKp相比，hvKp的一个明显特征是存在毒力质粒。该质粒通常包含多个毒力编码基因，并可在菌株间转移，是hvKp菌株呈现高毒力的重要原因。最早被鉴定的两个毒力质粒是pK2044(224 152 bp)和pLVPK(219 385 bp)，两个毒力质粒高度相似，都是IncHI1/IncFIB质粒，含黏液表型调节基因rmpA/rmpA2、气杆菌素编码基因iuc和沙门菌素编码基因iro[10, 24]；但不含质粒接合转移基因，因此，不具有自主接合转移功能，可能与过去很长一段时间内，肺炎克雷伯菌中高毒力和耐药表型不相重叠的现象有关[35]。随着研究的深入，越来越多的毒力质粒相继被鉴定出来，甚至发现了与耐药基因共存的毒力质粒。如Gu等[12]指出，类pLVPK毒力质粒pVir-CR-HvKp4(178 154 bp，含rmpA2、iucABCD、iutA，缺rmpA、iroBCDN)可转移到耐碳青霉烯类cKp菌株中，实现与耐药质粒pKPC-CR-HvKP4共存，并形成耐碳青霉烯类hvKp菌株；该耐药与毒力结合的hvKp菌株在当地医院引起感染暴发，并导致病死率100%。同样地，将pLVPK毒力质粒的100 kb片段整合到接合性IncFIB质粒中，形成p15WZ-82-vir毒力质粒，可与耐碳青霉烯类cKp接合，并表达出高毒力和呈现耐药表型[36]。此外，人们还发现新的共存形式的毒力质粒—杂交毒力质粒，此类质粒将耐药基因重组到毒力质粒中，形成既含有毒力相关基因又含有耐药相关基因的新质粒。Dong等[37]从临床hvKp菌株中分离出的杂交质粒pKP70-2(240 kb)，同时含毒力基因rmpA2以及碳青霉烯酶基因blaKPC-2和甲氧苄啶抗性基因dfrA。Huang等[38]通过WGS在TVGHCRE225菌株中也检测出一个杂交毒力质粒pVir，该质粒第一区域与pK2044和pLVPK质粒有99%的同源性，含毒力基因rmpA和rmpA2；第二区域则与pPMK1-NDM抗性质粒高度相似。这些hvKp耐药株，同时具有高毒力、耐药性以及移动性，可在医院或社区引起严重感染[39]。而杂交毒力质粒将耐药和毒力基因融合在同一质粒中，其在菌株间转移所带来的威胁更大。

2.4 ICEs ICEs是细菌中可自主移动的元件，通常存在于细菌染色体上，自身即可完成转移的相关编码，并携带多种功能基因，是毒力和耐药播散的重要介质。肺炎克雷伯菌中的ICEs可依据其右端携带的不同cargo基因簇分为14种类型 (ICEKp1～ICEKp14)，各ICEs间有以下共性：(1)左端有一个整合酶基因int；(2)有编码耶尔森菌素的29 kb位点；(3)有编码xis激活酶、virB-IV型分泌系统、oriT转移起点和mobBC蛋白的14 kb序列[40]。hvKp菌株中以ICEKp1和ICEKp10常见。ICEKp1在hvKp菌株NTUH-K2044中被首次发现，其5’区域有一个高致病性岛(high pathogenicity island, HPI)，编码耶尔森菌素、沙门菌素和黏液表型调节因子rmpA，3’区域含接合转移基因[41]。ICEKp10编码耶尔森菌素和基因毒素colibactin，但缺少rmpA和iro基因[42]。ICEs普遍存在于肺炎克雷伯菌中，尤其是hvKp菌株。近90%的CG23菌株和近75%的hvKp菌株均含ICEs[10]。Lam等[40]对肺炎克雷伯菌中ICEs的流行、进化和迁移性进行研究，发现ICEs主要通过基因水平转移在肺炎克雷伯菌种群(包括多重耐药肺炎克雷伯菌)中动态循环，极大地促进肺炎克雷伯菌间的遗传物质交流。Farzand等[43]发现，ICEKp2虽与铜绿假单胞菌PAPI高度同源，广泛分布于铜绿假单胞菌中，但在肺炎克雷伯菌中也有少量分布，当ICEKp2和ICEKp1存在于同一肺炎克雷伯菌中，ICEKp2的4型偶联蛋白促进ICEKp1在肺炎克雷伯菌间转移，此为ICEs促进毒力和耐药性播散提供了新的作用途径。另外，最近一项研究[44]显示，ICEKp的缺失可使肺炎克雷伯菌铁载体分泌减少，抗菌药物抗性降低，并指出此与ICEkp编码的耶尔森菌素ABC转运蛋白相关。

2.5 铁载体 铁是细菌生长所必需的，而铁载体可在低铁环境中(如人类宿主)以极高的铁亲和力为细菌提供铁，促进细菌生长和繁殖[10]。hvKp比cKp产生更多的铁载体，且铁载体活性提高了6～10倍[1]。hvKp能产生4种铁载体：肠杆菌素、耶尔森菌素、沙门菌素和气杆菌素。肠杆菌素普遍存在于肺炎克雷伯菌中，但由于其能被宿主载脂蛋白2灭活，在感染中几乎不发挥作用。耶尔森菌素也广泛存在于肺炎克雷伯菌，但在hvKp中更常见，研究[24]表明，耶尔森菌素与侵袭性感染(菌血症、肝脓肿等)风险增加显著相关。编码耶尔森菌素的ybt基因存在于FIBK质粒上。FIBK质粒在肺炎克雷伯菌中非常普遍且高度稳定，并且许多FIBK质粒已获得AMR转座子，使得AMR与毒力基因的聚合几乎不存在障碍，可极大地促进hvKp菌株的耐药性[40]。编码沙门菌素和气杆菌素的基因存在于毒力质粒上，因此沙门菌素和气杆菌素是hvKp特有的。其中，气杆菌素占铁载体总量的80%～90%，对hvKp生长和存活至关重要，可协助hvKp从肠道转移到各种组织并在这些组织中繁殖，从而引起严重感染[1, 24]。气杆菌素由iucABCD操纵子编码，其同源受体由iutA基因编码。沙门菌素在hvKp感染中的具体作用还未明确，有研究[45]指出沙门菌素似乎与微球菌素E492一起促进hvKp菌株在宿主中定植。

2.6 其他 hvKp菌株的高毒力表型受多种毒力因子的共同作用，除了上述毒力因子外，还有其他可能发挥作用的毒力因子。一是peg-344，其位于hvKp菌株hvKp1的毒力质粒上，可增加hvKp1的毒力，并在hvKp菌株中广泛流行[46]，用peg-344环介导的等温扩增技术可快速分辨hvKp和cKp[47]。二是尿囊素，其在肺炎克雷伯菌中既是氮源又是碳源。研究[48]表明，尿囊素在K1 hvKp菌株中更常见，肺炎克雷伯菌对尿囊素的利用能力可能有助于其对氮源的竞争。尿囊素代谢受基因allB(尿囊素酶)、allR(负调节剂)、allS(转录激活因子)和ybbW(丙氨酸通透酶)调控。三是Colibactin ，是一种多肽类基因毒素，由位于ICEkp 54 kb位点上的clb基因(也称pks基因)编码的非核糖体肽合成酶-聚酮合成酶的合成，并通过ICEkp实现菌株间的基因水平转移[3]。Colibactin可诱导DNA双链断裂，扰乱宿主细胞周期，还有助于hvKp菌株在宿主体内定植，导致小鼠感染K1 ST23肺炎克雷伯菌[49]。四是cAMP受体蛋白，是一种具有多效性的转录调节因子，可负调控荚膜多糖生物合成，其突变体能产生更高的CPS水平，但会降低肺炎克雷伯菌NTUH-2044生物膜形成能力、生长速率和毒力[50]。因此，cAMP受体蛋白是否具有同时调控其他毒力因子的功能，以及对hvKp毒力的具体调控作用仍待明确。最后是hvKp菌株形成生物膜的能力，Wu等[51]研究发现，hvKP比cKp产生更多的生物膜。但也有研究[52]提出，hvKp与cKp生物膜形成能力无差异，且生物膜形成能力对hvKp毒力无明显影响。因此，生物膜形成与hvKp引起的侵袭性感染是否相关，仍值得进一步研究。

3 HvKp相关耐药机制

相比于cKp对抗菌药物的高耐药率，hvKp对抗菌药物的耐药率普遍较低。但近年来随着可移动遗传元件在全球的快速传播，已观察到两种融合方式形成耐药hvKp菌株：获得毒力基因的cKp菌株和获得耐药基因的hvKp菌株。以下就hvKp相关耐药机制进行阐述。

3.1 基因水平转移 基因水平转移是指在非亲子关系的有机体之间共享遗传物质，通常与细菌的抗菌药物耐药性和致病性相关，通过质粒、ICEs、转座子等移动遗传元件，以接合、转导和转化等方式播散或获得耐药性或毒力。接合是指供体细胞和受体细胞之间通过接合菌毛进行物理接触而实现遗传物质转移；转化是指从环境中摄取外源遗传物质；转导是指外源遗传物质整合到噬菌体基因组中并通过噬菌体传递[53]。其中，接合是细菌中最常见的基因水平转移[54]。接合转移由参与DNA转移和复制(Dtr)、交配对形成(Mpf)的相关转移基因调控。Dtr基因是松弛酶处理DNA所必需的，松弛酶在转移起点的nic位点切割DNA分子，并保持附着在DNA单链上；Mpf编码负责合成T4SS的蛋白；松弛酶与DNA链相连，通过T4SS形成的孔道转移到受体细胞，最后借助ssDNA结合蛋白、反限制蛋白和SOS抑制蛋白产生稳定的接合子[55]。一般情况下，转移基因处于关闭状态，当感知到特定信号(如特定受体的存在、高细胞密度以及氧气、温度变化等)时可开启并诱导基因的接合转移[55]。质粒和ICEs通常能自行完成接合转移，或者在其他基因组元件的帮助下进行接合转移。如前述cKp耐药株可获得ICEs或接合性毒力质粒而进化为hvKp耐药株。反之，hvKp菌株亦可获得耐药质粒而形成hvKp耐药株。Yang等[56]研究发现，hvKp菌株(pKpn1693，K1 ST23)可获得含碳青霉烯酶基因blaCTX-M-24的IncFII型质粒；在该菌株的染色体上还发现了多个外排泵基因和耐药基因，因此，还对磷霉素、多粘菌素、广谱β-内酰胺类和氟喹诺酮类等耐药。Huang 等[38]对hvKp的喹诺酮类耐药机制进行研究，发现hvKp的耐药质粒上含喹诺酮类耐药的关键基因qnrA1，此外，gyrA和parC基因的突变也参与了喹诺酮类药物耐药。

3.2 AcrB外排泵 在许多革兰阴性杆菌中，抗性结瘤细胞分裂超家族(resistance-nodulation-cell division，RND)是主要的药物外排泵，可通过三个连续构象(进入、结合和挤出)的循环将药物排出。其通常以不对称的三聚体形式存在，含有12/13/14个跨膜螺旋，位于螺旋1和2以及7和8之间的两个大的外环，跨膜域主要作为能量源质子的管道，外部环包含与输出配体结合的位点[57]。而三聚体内膜成分吖啶黄素抗性蛋白B(acriflavine resistance protein B，AcrB)是药物/质子逆向转运过程中的药物特异性识别和能量转导中心，与周质蛋白AcrA和外膜蛋白TolC作为一个三方系统协同工作。其在结构上可以分为对AcrB三聚重要的漏斗结构域或对接结构域(FD)，负责能量转导以促进药物转运的TMD，以及包含结合位点并介导底物识别、摄取和转位的转运蛋白结构域(PD)[58]。AcrB由acrB基因编码，可被ramA、soxS、marA、rob和acrA等基因激活而过表达，进而降低肺炎克雷伯菌对药物，如喹诺酮类药物(萘啶酸、环丙沙星)和头孢西丁、氯霉素、红霉素、替加环素等的敏感性[59-60]。但ramR、soxR、acrR等可通过抑制acrB，恢复细菌对抗菌药物的敏感性[61]。AcrB外排泵介导的耐药在hvKp菌株中也得到了证实。Srinivasan等[62]在hvKp菌株(NTUH-K2044)中发现一个新的信号转导调控蛋白—LysR型转录调节因子oxyR，其与acrB表达正相关；△oxyR突变株的acrB相对表达量约降低为原来的1/5，同时阿莫西林、氯霉素、红霉素、萘啶酸、利福平和甲氧苄啶的最低抑菌浓度也随之降低。Huang等[38]研究也表明，相对于对照株KP478，hvKp菌株(VGHCRE225)的外排泵基因acrB及其调控基因ramA过表达，同时AcrB的负调控基因acrR和ramR分别被插入序列ISKpn26，发生错义突变，此与替加环素耐药性有关。

3.3 脂多糖修饰 脂多糖是肺炎克雷伯菌细胞膜的主要成分之一，在结构上主要包含三种成分：将整个结构锚定在细胞膜中的脂质A成分、核心寡糖和称为O抗原的末端侧链[28]。其中脂质A是位于细胞膜外单层的疏水部分，由lpx基因簇编码的一系列酶合成。脂质A由于游离磷酸基团的存在而带有负电荷，而多粘菌素对脂质A负电荷具有高亲和力，两者结合后可破坏脂多糖的稳定性，使细胞外膜不完整，最终导致多粘菌素进入细胞质而发挥杀菌作用[63]。但当脂多糖中带正电的残基如4-氨基-L-阿拉伯糖、磷酸乙醇胺或氨基半乳糖增加，则可改变脂质A的负电荷状态，从而减少多粘菌素与脂质A间的相互作用并增强多粘菌素抗性。4-氨基-L-阿拉伯糖的生物合成由pmrEHFIJKLM基因编码的蛋白质调控，而pmrEHFIJKLM基因受双组分信号转导系统PmrAB的直接调节和 PhoPQ的间接调节[64]。PmrAB 还通过磷酸乙醇胺转移酶PmrC控制合成磷酸乙醇胺所需基因的表达[65]。Huang等[38]研究也证实，hvKp菌株中pmrHFIJKLM的高表达增加了脂多糖的修饰，通常与多粘菌素抗性有关。Choi等[66]研究表明，hvKp中多粘菌素抗性的获得与编码phoPQ或pmrAB基因的上调，以及pmrD和pbgP基因表达的增加有关，并且指出这种抗性可能导致与毒力相关的表型缺陷，如荚膜多糖、HMV表型和血清抵抗力等。另外，Lee等[67]指出，携带mcr-1基因的质粒是革兰阴性菌产生多粘菌素抗性的重要原因，并可通过水平基因转移；mcr-1基因编码一种磷酸乙醇胺转移酶，催化磷酸乙醇胺与脂质A反应，进而介导多粘菌素抗性。此与研究[11-12]结果一致。Sellick等[68]在小鼠体内研究发现，mgrB突变诱导PhoPQ调控的脂质A重塑，进而赋予肺炎克雷伯菌对多粘菌素的抗性。随后，研究[69]表明，此机制亦出现在hvKp中，发现IS Kpn18对mgrB基因的截断，导致对多粘菌素和碳青霉烯类耐药hvKp的出现。

4 总结与展望

自1980年中国台湾首次报道以来，hvKp已在包括中国、印度、欧洲和美国等多个国家甚至全球范围内被报道[48, 69]。hvKp能引起健康人群感染，且一旦感染极易导致多部位感染，造成极高的病死率。多重耐药hvKp的出现更是增加了感染患者的治疗难度。目前已有研究[24]证实，hvKp的高毒力受毒力质粒、ICEs、铁载体、荚膜多糖等多种相关因素调控，但有关hvKp耐药机制的研究仍较少，同时有关hvKp毒力因子及其耐药机制相关性的研究更少。虽然，目前hvKp耐药率仍远低于cKp，但耐药hvKp感染一旦出现，往往造成难以预估的严重后果。因此，对于hvKp毒力因子、耐药机制以及其相关性的研究是非常有必要的。本综述详细介绍了hvKp菌株相关毒力因素以及可能存在的各种耐药机制，旨在探讨hvKp的耐药性是否与其高毒力相关，为临床诊疗提供一定的参考意见。此外，针对目前越来越多的多重耐药hvKp菌株的出现，更加有效的药物开发非常必要，而根据hvKp菌株毒力因子以及耐药机制寻找新的阻断方式是未来可以考虑的一个方向。