外泌体及其miRNA治疗化疗所致早发性卵巢功能不全的研究进展*

张秀娟，张瑞红，郝 晶，吕梦潇，苏 婵，穆玉兰**

(1.山东第一医科大学附属省立医院妇产科，济南 250021；2.山东大学基础医学院，济南 250012))

据统计，全世界每8对育龄夫妇中就有1对患不孕不育症[1]，不孕不育已成为继心脑血管和肿瘤之后威胁人类健康的第三大疾病，而肿瘤生育作为不孕不育治疗领域的新型分支，其重要性逐渐受到重视。流行病学文献报道，世界范围内50岁以下妇女5%罹患肿瘤。由于肿瘤的早诊断和早治疗措施的推广，肿瘤患者5年生存率显著提高，且年轻患者生存率显著高于高龄患者。据报道，35岁以下乳腺癌患者的生存率为90.91%，35～45岁患者的生存率为57.84%[2]。化疗作为肿瘤治疗的重要方案，可导致卵巢不可逆转损伤，因此育龄期妇女和青少年女性抗癌期间的生育力保存受到更多的关注[3]。美国生殖医学协会(ASRM)推荐的生育力保存方式，仅有胚胎和成熟卵的冻存[4]。此外，若抗苗勒管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)基础水平持续低于3.32ng/mL，放疗后即使没有闭经，也可能导致生育问题[5]。虽可长期使用激素补充治疗(hormone replacement therapy，HRT)缓解围绝经期症状，但不能防止其发生和进展，因此迫切需为早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者找到一种新的临床治疗策略。近年研究发现，卵巢组织、干细胞及其外泌体移植可部分或完全恢复化疗性POI，其中外泌体以及其转运的miRNA为POI的诊治提供了新思路。

1 化疗所致POI的病因及机制

POI是指卵巢功能衰竭所导致的女性在40岁之前出现闭经的现象，特点是原发或继发性闭经，血促性腺激素水平升高、雌激素水平降低、卵泡数量减少等[6]。POI分为原发性和继发性两种。原发性POI一般由遗传、免疫、炎症、酶代谢紊乱等引起，但大多原因未明；继发性POI一般由手术、放疗、化疗和其他接触毒性物质引起[7]。大剂量放疗、化疗或骨髓移植可使超过90%的年轻女性恶性肿瘤患者的病情得到缓解，但对卵巢功能和生育力造成不良影响。化疗造成卵巢功能衰退的主要机制可分为两类：(1)对卵母细胞和卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells，OGCs)的直接毒性作用；(2)通过损伤生长卵母细胞间接造成原始卵母细胞过度活化从而耗竭[8]。其中化疗药物顺铂在化疗过程中使原始卵母细胞库持续激活、卵泡过度凋亡导致卵巢衰竭；而化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)诱导卵巢间质细胞和颗粒细胞水肿和凋亡，通过线粒体释放细胞色素c激活凋亡通路，诱导DNA损伤，从而消除高度分裂的细胞，如卵母细胞[9]。造成原始卵母细胞凋亡或激活的细胞信号传导途径之一为磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tension homolog,PTEN)依赖性信号途径。研究表明，PTEN/AKT/FOXO3信号途径参与了小鼠原始卵母细胞和体外培养的人卵母细胞的激活，而PTEN抑制剂则可解除其抑制功能[10]。Huang等[6]研究表明，化疗后患者卵巢功能可出现一定程度的恢复,性激素改变及化疗引起的闭经在一定程度上可以逆转,恢复情况与化疗药物的累计剂量和卵巢损伤程度有关。但目前关于化疗所致POI尚无明确的治疗方法，只能根据相关临床症状采取相应措施。

2 干细胞用于POI治疗

POI患者使用HRT后，癌症风险及副作用增加，因此科学家提出运用干细胞治疗POI。干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，并且已有研究表明人羊膜、脐带、骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞以及人羊膜上皮细胞、羊水干细胞卵巢注射可部分或完全恢复卵巢功能。但以干细胞为基础的治疗仍面临一些挑战，包括移植排斥、肿瘤转化、来源有限、伦理问题等，导致其在临床应用中受到限制[11]。基于此，研究者着眼于干细胞内的有效物质，发现外泌体不仅可治疗某些疾病，还可在胚胎发育、配子发生和受精的生物学功能中发挥重要作用。相较于干细胞，外泌体具有低免疫原性、不致瘤性、高临床安全性和低伦理风险等优点[12]。国内外研究已证实，外泌体在改善POI方面具有重要作用。

3 外泌体用于POI治疗

外泌体介导的干细胞与靶细胞之间的相互作用作为新的细胞间作用方式，可能为临床治疗POI提供新的策略。外泌体属于细胞多泡体，是多泡体外膜与细胞膜融合后释放到细胞外的一种直径小于150nm的均一膜性囊泡，通过携带mRNA、miRNA、circRNAs、lncRNAs及蛋白质等信号分子，借助靶细胞内化、配体-受体相互作用或脂膜融合来完成邻近或远距离细胞间信号传递，进而发挥重要的生理或病理功能[13-14]。研究病变组织外泌体及其成分变化为发现新的疾病诊断标记物、探索新的发病机制以及开发新的治疗措施提供可靠的技术手段和依据。

3.1 间充质干细胞来源外泌体 间充质干细胞是多能干细胞，优点是容易获得和免疫原性不完全，可来源于骨髓、脐带、羊膜、脂肪等组织。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有来源方便、无伦理问题等优点；缺点是对同种异体移植产生免疫反应及潜在的致瘤性[15]。而外泌体是较为合适的选择：(1)与干细胞相比，安全，无致瘤倾向；(2)非免疫原性外泌体在体内耐受性好，循环半衰期长，免疫原性低[16]。Sun等[8]证实，BMSCs来源的外泌体(BMSCs derived exosomes，BMSCs-Exos)可改善卵巢早衰(premature ovrian failure，POF)小鼠的卵泡形态，抑制凋亡相关蛋白c-caspase 3、p53表达；与原代卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells,OGCs)共培养，明显抑制顺铂诱导的OGCs凋亡，改善卵泡衰竭和闭锁，提高细胞活力。Yang等[7]发现，BMSCs-Exos移植显著恢复POF大鼠的发情周期，增加始基卵泡和窦卵泡数，提高血清中E2和AMH水平，降低FSH、LH及caspase 3和caspase 9水平，缓解CTX所致的卵巢损伤。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)表达了BMSCs的全部生物学特性，且具有良好的增殖分化潜能，临床应用广泛[17]。Sun等[18]研究表明，hUMSCs-Exos使顺铂组Bcl-2表达上调，bax、caspase-3和PARP表达下调以保护OGCs，提示hUMSCs-Exos体外预防和治疗化疗诱导的OGCs凋亡。Ding等[16]表明，hUMSCs-Exos增加POI小鼠OGCs及卵泡的增殖速率，降低凋亡率，且呈剂量依赖性。其分子机制主要是通过抑制CTX损伤的OGCs中SIRT7及下游靶基因的表达，从而恢复卵巢功能。同年该课题组首次发现人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)来源的外泌体(hAMSCs-Exos)能促进卵巢细胞增殖，降低OGCs和卵母细胞的SIRT4和ROS水平，并改善POI小鼠卵巢重量和产仔数[19]。Huang等[6]发现，人脂肪干细胞(human adipose mesenchymal stem cells，hADSCs)来源外泌体(hADSCs-Exos)可恢复化疗损伤的卵巢功能，显著促进卵泡增殖，抑制细胞凋亡，使相关激素E2、AMH、FSH水平升高至正常。此外，hADSCs-Exos通过激活SMAD抑制凋亡基因Fas、FasL、caspase-3和caspase-8的表达，表明其可通过调节SMAD通路来恢复POI患者卵巢功能。

3.2 羊水干细胞及羊膜上皮细胞来源外泌体 羊水干细胞(amniotic ?叢uid stem cells，AFSCs)来源于胚胎外层，是兼具胚胎干细胞和成人干细胞的多能干细胞，与间充质干细胞相比增殖更快。Xiao等[20]证明，AFSCs-Exos能抑制CTX所致OGCs的凋亡。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell，hAECs)保留了胚胎干细胞的特性，包括免疫调节、抗炎特性和低免疫原性[21]。由于这些有利的特点，hAECs已在再生医学广泛应用，在肺损伤、脑损伤和肝纤维化等移植治疗后取得了良好的效果[22-23]。Zhang等[6]证实，hAECs-Exos能明显抑制卵巢衰竭引起的OGCs凋亡，保护卵巢血管免受损伤，参与维持受损卵巢中原始卵泡数，改善卵巢功能。并通过KEEG和GO分析表明，hAECs来源的外泌体逆转化疗影响的某些生物学过程，包括棕色脂肪细胞分化、脂肪代谢过程或途径、增殖物激活受体γ(PPARg)和AMP活化蛋白激酶信号途径，同时该过程证实hAEC-Exos具有修复POF小鼠卵巢功能的潜力。

总之，某些干细胞来源的外泌体可改善化疗所致POI/POF实验动物的内分泌及生殖功能。但是由于外泌体提取需要耗费大量精力，并且纯度及量不能达到预期，因此寻求外泌体中发挥作用的有效物质是新的突破点。

4 外泌体miRNA用于POI治疗

4.1 外泌体转运的miRNA miRNA是一类长度约为22～24个碱基的内源性单链非编码RNA，广泛存在于真核生物体内，并在进化上相对保守，通过与Agonaute一起结合在信使mRNA3'非编码区(UTR)来调节基因的翻译水平。miRNA有自己特异的结合靶位，在细胞增殖、分化、迁移、维持内稳态以及凋亡中发挥重要的调节作用[24]。miRNA的异常表达与多种疾病密切相关，如来自癌细胞的外泌体miR-205能调控血管生成和肿瘤的转移[25]；miR-106a与卵巢发育密切相关，其表达下调可抑制卵巢癌细胞的生长和转移[18]。近年miRNA与POI的研究逐渐增多，这些研究不仅证实了外泌体中miRNA对POI的治疗作用，还探讨验证了相关机制。

4.2 外泌体miRNA治疗POI Xiao等[20]发现，AFSCs-Exos来源的miR-10a可抑制OGCs凋亡，阻止化疗后卵泡闭锁，可能有助于卵泡的保存；hAEC-Exos来源的miR-1246和miR-21-5p过表达可显著逆转化疗引起的凋亡蛋白caspase 3的表达[6]。另有研究证实huMSC-Exos来源的miR-644-5p分别通过调节靶基因PTEN、p53抑制受损的OGCs凋亡，抑制化疗所致的卵巢衰竭[8]。2019年江苏大学朱晓兰课题组通过miR-144-5p抑制PTEN来改善化疗导致的卵巢衰竭症状[7]。2020年Ding等[16]研究显示，huMSCs-Exos通过激活 miR-17-5p 抑制SIRT7及其下游靶基因的表达改善POI患者的卵巢功能，卵巢总卵泡数量明显增加，血清E2和AMH水平明显升高，卵巢大小和重量明显增加。进一步研究表明huMSCs-Exos通过递送 miR-17-5p 抑制ROS的积累，并证实了外泌体 miR-17-5p 在人胚胎干细胞和卵母细胞中抑制活性氧水平的关键作用。同年，该课组研究发现hAMSCs-Exos的miR-320a可通过调控SIRT4蛋白表达诱导细胞增殖，维持卵巢功能进而改善POI[19]。两项研究分别对huMSCs-Exos的 miR-17-5p、hAMSCs-Exos的miR-320a基因敲除，更为精准地研究了miRNA对POI的作用及机制，证明了外泌体miRNA可有效缓解POI。

5 精准研究外泌体miRNA

目前科学家对于miRNA分子功能的研究主要集中于患者病变组织和体外培养的细胞，而其在组织细胞发育和发病过程中的具体功能尚不明确[26]。基因敲除模型为精准研究miRNA的功能提供了重要的技术手段[27]。鉴于真核细胞的基因表达调控机制复杂，且miRNA在基因调控中起辅助作用，miRNA分子基因敲除基本上不表现出明显的表型变化。在线虫中，低于10%的miRNA分子敲除不会造成胚胎发育障碍或明显的表型变化，且基因敲除对线虫或小鼠造成的变化主要发生在压力或损伤等应激状态下[28]。基因敲除已为阐明miR-126[29]、miR-132[30]、miR-17-5p[16]、miR-320a[19]等分子的生理功能发挥了不可替代的作用。欲精准研究某一miRNA的生物学特性，可运用相关技术系统制备生殖细胞miRNA基因敲除模型及卵巢组织特异的基因敲除模型，从而研究某一miRNA基因敲除小鼠整体、卵巢生长发育状况及组织反应，由此可精准推测出某一特定miRNA在改善POI方面是否有效。

6 展 望

化疗所致POI患者恢复情况与化疗药的累计剂量和卵巢损伤程度有关，在化疗后进行早期干预可使卵巢功能有一定程度的恢复。但是由于化疗所致POI机制复杂多变，临床上尚无有效的治疗方法。研究证实，外泌体及其miRNA可显著改善化疗药物所致POI的相关症状，其作用机制及安全性有待深入研究。探索外泌体及其miRNA与卵巢细胞的作用机制，有利于研发新的POI治疗方法，改善POI患者的内分泌及生育功能。