口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测快捷方法

2021-03-28 15:57莫荣艳熊丽文梁惠娟黎益图
今日畜牧兽医 2021年1期
关键词:孔中恒温箱稀释液

莫荣艳,熊丽文,梁惠娟,黄 钰,黎益图,何 涛,覃 磊

(来宾市动物疫病预防控制中心 546100)

本实验应用液相阻断ELISA 检测方法检测猪血清样品80份,快速检测猪的O 型口蹄疫抗体效价≥1∶64 有多少份。 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系:猪的抗体效价≥1∶64,99%以上保护;抗体效价<1∶4,不保护;效价在1∶4~45,50%保护。

1 材料和方法

检测样品:猪血清80 份(样品不能有溶血状态、受污染、破损、变质),编号为DA1~DA80。

实验器材:酶标仪;37℃恒温箱;超纯水仪;移液器;配套移液枪尖;96 孔U 型微量血凝板;移液槽;吸水纸;检测试剂盒是中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫病毒O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒。

2 试剂准备

将口蹄疫病毒O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒从冰箱取出,放置常温解冻,试剂恢复常温后使用。 打开超纯水仪,取出2L 超纯水装在容器备用,按照检测试剂盒说明书,配制25倍PBST 浓缩液,用超纯水稀释成1 倍PBST(例如:1mL 浓缩液加入24mL 超纯水)。 打开恒温箱电源,设置温度到37℃,温度上升到37℃才能按实验要求正常工作。 配制口蹄疫O 型病毒抗原:按照抗原配制比例,用PBST 稀释液稀释到工作浓度(1∶25,即1mL 病毒抗原加24mL PBST 稀释液)。

3 实验操作步骤

3.1 稀释血清 80 份血清需要96 孔U 型微量血凝板共5块,在血凝板边缘标记数字(横向标记为1,2-12,纵向标记为A,B-H),一块板可以稀释16 份血清样品。例如编号为DA1 的血清样品,先在血凝板上A1~A5 孔中入PBST 稀释液50μL,然后在第A1 孔加入血清样品50μL, 混匀后吸出50μL 移到第A2 孔,依次稀释到第A5 孔, 从第A5 孔中吸出50μL 移到抗原抗体反应板(例如放在A1 孔)。把所有样品稀释完后移到抗原抗体反应板,对样品所在的位置做好标记。 用10~100μL 8 道移液器来稀释血清,这样效率更高。

3.2 阳性对照稀释 在抗原抗体反应板A11~H11 孔先加入PBST 稀释液50μL/孔, 然后在A11 孔中加入阳性对照50μL,混匀后吸出50μL 移到B11 孔,依次稀释到H11 孔,从H11 孔中吸出50μL 弃掉。

3.3 阴性对照稀释 在抗原抗体反应板A12~B12 孔 (例如)先加入PBST 稀释液50μL /孔, 然后在A12 孔中加入阴性对照50μL,混匀后吸出50μL 移到B12 孔,从B12 孔中吸出50μl 弃掉。

3.4 在样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔中加入50μL/孔口蹄疫O 型病毒抗原(1×),在E12~H12 孔中只加口蹄疫O 型病毒抗原(1×)100 μL /孔,盖膜封板,振荡反应板10s 左右,然后放冰箱4℃静置过夜或放恒温箱37℃温育90min。

3.5 将抗原抗体混合液从抗原抗体反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O 型兔抗的ELISA 板上,50μL /孔, 盖膜封板,放恒温箱37℃温育60min。

3.6 从恒温箱取板出来,甩掉板上的液体,每孔加入300μL PBST 稀释液洗板,连续洗板3~5 次,在吸水纸上甩干(可以把反应板倒置对着灯光看,孔里没有水珠就可以了)。 按50μL /孔加口蹄疫O 型豚鼠抗体工作液, 盖膜封板, 放恒温箱37℃温育30min。

3.7 从恒温箱取板出来,甩掉板上的液体,每孔加入300μL PBST 稀释液,连续洗板3~5 次,在吸水纸上甩干,按50μL /孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液, 盖膜封板, 放恒温箱37℃温育30min。

3.8 从恒温箱取板出来,甩掉板上的液体,每孔加入300μL PBST 稀释液,连续洗板3~5 次,在吸水纸上甩干,TMB 底物A 溶液和底物B 溶液以1∶1 比例混匀, 用移液器吸出TMB 底物A 溶液2.5mL 和底物B 溶液2.5mL 混匀(按实际用量计算,免得浪费试剂),加入混匀的底物溶液50μL /孔,37℃避光(可以在包被板上盖上报纸)显色15min。

3.9 从恒温箱取板出来,加入终止液50μL /孔,终止反应,打开酶标仪,在酶标仪上读取D450nm 值。

4 结果判定

4.1 实验认可标准:每板设4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照D450nm 值应在1.0 以上。阳性对照抗体效价应在1∶1024±1 滴度以内,阴性对照血清抗体效价应<1∶8。

4.2 血清抗体效价的判定:病毒抗原对照4 孔,弃去最高和最低D450nm 值,计算剩余2 孔的平均D450nm 值,再除以2,即50%对照值, 该值即为临界值, 表示阻断50%反应的对照D450nm 值。 被检血清D450nm 值大于临界值的孔为阴性孔,小于等于临界值的孔为阳性孔。

5 小结与讨论

液相阻断ELISA 免疫抗体检测方法,具有灵敏性、特异性和稳定性,能及时、准确的监测抗体,为防控口蹄疫O 型疫病提供了有效保障。 80 份猪血清, 结果是阳性有78 份,阴性有2 份,抗体保护率为98%。 通过这个口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测快捷方法,能快速、高效的提高工作效率。

猜你喜欢
孔中恒温箱稀释液
制作声音盒
不同稀释液对鸡新城疫活苗免疫效果评价
不同精液稀释液对海扬黄鸡配套系亲本精液品质的影响
端午节香包
然后
环境试验设备温度偏差校准结果不确定度分析
恒温箱温度计量性能参数的调优
猪精液常温保存稀释液配方筛选试验研究
温度和稀释液对猪精液保存效果的影响
本报更正