甲状腺癌中参与上皮-间质性转化的生物学改变

吉丽银 符策岗

(1中南大学湘雅医学院附属海口医院乳甲外科，海南 海口 570208；2上海市第六人民医院海口医院骨科)

甲状腺癌以甲状腺上皮肿瘤(甲状腺滤泡细胞来源)最常见，根据病理可分为3种类型：乳头状甲状腺癌(PTC)、滤泡状甲状腺癌(FTC)和未分化甲状腺癌(ATC)〔1，2〕。此外，髓样癌(5%～10%)来源于甲状腺的C细胞〔3〕。大多数甲状腺癌在行根治性切除术+放射性碘治疗后，长期生存率极高，但部分不可切除、易复发、对放射性碘治疗顽强抵抗和发生转移的甲状腺癌仍然是致死的主要原因。研究已证实甲状腺癌侵袭性与上皮-间充质转变(EMT)紧密相关〔2,4〕。EMT本质上是一种细胞的形态学变化过程，上皮细胞通过触发转录事件获得成纤维细胞才具备间充质细胞特点〔5〕。在EMT中，上皮细胞脱分化并摆脱原有的组织结构限制，从原本的卵石形状转变为细胞融合形态(与细胞骨架的重排有关)〔6〕。这一过程涉及多种细胞-细胞接触有关蛋白地水解、细胞运动黏附分子活性地增加、细胞表面蛋白酶地激活、细胞外基质(ECM)成分的逐步消化等〔5〕。最终表现为癌细胞将上皮细胞中常见的E-钙黏蛋白和细胞角蛋白转换为间充质细胞常备的纤维连接蛋白、波形蛋白或神经钙黏蛋白(N-钙黏蛋白)，这与肿瘤侵袭性增加密切相关〔6〕。EMT过程涉及多种信号转导途径、转录因子(TF)和特异性蛋白，本文对在甲状腺癌中参与EMT的生物学改变进行综述，重点关注信号转导途径、TF和特异性蛋白的变化。

1 多种信号途径参与EMT

转化生长因子(TGF)-β信号转导途径在EMT中扮演重要的角色，TGF-β激活受体调节的Smad并与Smad4结合，后被转运到细胞核中并发挥调节基因转录的作用〔7〕。在正常甲状腺细胞中观察到TGF-β/Smad依赖性信号成分的表达，但PTC肿瘤中的表达明显高于正常甲状腺组织〔7〕，并介导EMT中的间质转化和E-钙黏蛋白的丢失〔8〕。此外，TGF-β/Smad途径的激活还可通过p27抑制Bax，并促进甲状腺肿瘤的生长〔9〕。此外，TGF-β还通过BRAFV600E激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)且触发肉瘤(Src)/黏着斑激酶(FAK)途径，并改变细胞间的黏附性从而促进EMT〔4〕。BRAFV600E还可激活甲基乙基酮(MEK)-胞外调节蛋白激酶(ERK)途径，上调Snail并介导E-钙黏蛋白的缺失〔4,10〕。MAPK的激活将促进肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ在细胞中表达，并以此抑制E-钙黏蛋白并促进调N-钙黏蛋白和波形蛋白表达，从而促进PTC的EMT〔11〕。据报道，表皮生长因子(EGF)与其受体(EGFR)结合，可激活ERK/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)途径，从而促进波形蛋白表达并抑制E-钙黏蛋白表达，促进ATC中EMT〔12,13〕。肝细胞生长因子(HGF)与其受体c-Met结合可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)途径，促进甲状腺细胞地侵袭和EMT，当使用c-Met和PI3K抑制剂时，可反向上调E-钙黏蛋白和下调N-钙黏蛋白，从而实现对HGF诱导EMT的逆转〔14〕。研究发现，盘状结构域受体酪氨酸激酶(DDR)2在PTC中上调，并通过激活ERK2和Snail1诱导EMT〔15〕。目前已证明Notch1在甲状腺癌中表达活化，并参与EMT〔16〕。研究表明Notch可通过调节锚蛋白重复蛋白(NRARP)控制Notch和Wnt通路，并参与EMT〔17〕。Wnt/β-连环蛋白途径的激活能引起细胞核中β-连环蛋白的积累，促进EMT，沉默Wnt的整联蛋白共同受体(SDC4)可反向抑制EMT并促进PTC细胞凋亡〔18〕。此外，SDC4、H-RasV12和CSN6也被证实参与β-连环蛋白核组装，并参与EMT〔19,20〕。

2 多种转录因子参与EMT

锌指E盒同源结合蛋白(Zeb)1的上调与甲状腺癌细胞EMT密切相关。已经证明，Bcl-2关联抗死亡基因(BAG)3刺激β-连环蛋白在细胞核的积累并促进Zeb1过表达，过表达的Zeb1然后能直接结合E-钙黏蛋白基因启动子中的E-box，抑制其转录并促进EMT〔6〕。Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋TF，能直接与E-box位点(5- CANNTG-3)结合并下调E-钙黏蛋白表达〔21,22〕。Slug(Snail2)是E-box结合家族的成员，在甲状腺癌细胞及其转移中高表达，可作为转录抑制因子，抑制E-钙黏蛋白表达和间充质表型增加〔22,23〕。目前已经确定，性别决定区Y框蛋白(Sox)9在PTC中过表达，当沉默Sox9时，能抑制β-连环蛋白、周期蛋白D1和c-Myc(Wnt途径相关因子)，并扭转EMT(抑制N-钙黏蛋白，促进E-钙黏蛋白)〔24〕。研究证实，Runx2通过刺激基质金属蛋白酶(MMP)、血管内皮生长因子及EMT相关蛋白(包括Sox9，Snail2/Slug)过表达，对癌细胞转移具有促进作用〔25,26〕。与TF相反，FOXD3在EMT中发挥抑制作用，遗憾的是在肿瘤组织中检测到其表达降低，这与E-钙黏蛋白低表达并促进EMT有密切的内在联系〔27〕。此外，TBX1作为T-box TF家族的成员，可上调E-钙黏蛋白的同时下调N-钙黏蛋白、波形蛋白和E-钙黏蛋白抑制因子(Snail，Slug和Twist)，从而抑制EMT，但是在甲状腺癌组织中也是低表达状态〔28〕。

3 多种特异性蛋白参与EMT

E-钙黏蛋白作为表皮细胞中主要的链接蛋白，在EMT过程中主要变化是下调，是多种信号通路和转录因子参与EMT的靶向蛋白〔5〕。波形蛋白(一种中间丝的组分，其重组有助于细胞迁移)主要在间充质细胞中表达，其过度表达参与EMT地诱导〔6〕。骨膜素和纤维连接蛋白(FN)1在EMT期间分泌增加并改变细胞外基质(ECM)的组成，帮助肿瘤侵袭〔29,30〕。研究证实，在侵袭性PTC中骨膜素呈现过度表达，并参与EMT和肿瘤侵袭〔31〕。免疫组织化学证据表明，FN1表达上调并与BRAFV600E协同促进EMT进程〔29〕。另一个与转移过程相关的ECM蛋白家族是S100蛋白，已经证实S100蛋白在ECM中上调，并破坏细胞间黏附和促进ECM降解和转移，促进EMT〔32〕。IQGAP1作为在人体组织中广泛表达的支架蛋白，其表达增加与甲状腺癌细胞侵袭呈正相关，下调IQGAP1将阻断甲状腺癌细胞中的Wnt /β-连环蛋白信号并抑制EMT〔33〕。BAG3通过维持细胞死亡调节因子Bcl-2家族的活性实现抗细胞凋亡，以此抑制肿瘤转移时引发的anoikis凋亡(失巢凋亡，一种由细胞脱离ECM引发程序性细胞死亡)，参与甲状腺癌细胞的EMT和转移〔34,35〕。此外，BAG3还能通过活化β-连环蛋白上调Zeb1，从而增强甲状腺癌细胞的EMT和转移〔6〕。高迁移率族(HMG)A蛋白，在甲状腺癌细胞中证实，TGF-β1可通过PI3K和ERK信号诱导HMGA表达，并在促进EMT中发挥重要作用〔36〕，下调HMGA1能降低Snail和MMP-2的表达，而增加E-钙黏蛋白的表达〔36,37〕。

4 小 结

目前，少数分化良好的甲状腺癌患者和大多数复发及转移的低分化甲状腺癌(PDTC)和ATC患者对放化疗并不敏感。此外，大多数对放化疗不敏感的甲状腺癌细胞通常表现出EMT倾向。因此，更深入地了解EMT对探索和制定新的甲状腺癌治疗策略具有重要的意义。目前，研究主要集中于开发靶向EMT起始因子及其信号转导途径的低分子量化合物，目前有许多蛋白激酶抑制剂，如索拉非尼和乐伐替尼已经批准用于放射性碘难治性甲状腺癌患者，其他激酶抑制剂如达帕菲尼(BRAF抑制剂)和曲美替尼(MEK1/2抑制剂)用于治疗复发性甲状腺癌〔38〕。沉默Wnt/β-连环蛋白和C-Met/PI3K/AKT信号转导途径也被证实具有抑制甲状腺癌中的EMT作用〔14,39〕。

表观遗传学是近年研究热门之一，越来越多的证据表明表观遗传改变在EMT启动和维持中扮演重要的角色，而表观遗传学改变的可逆性也为逆转EMT提供了更多的可能。研究已经证实，MAPK信号途径在甲状腺癌中的激活与miR-21、miR-221、miRNA-222、miRNA-146b和miRNA-181的上调及miR-137、miR-375、miR-4728、miR-195和miR-9的下调有着密不可分的内在联系〔40〕。PI3K信号途径的激活也与miR-146a、miR-146b、miR-21、miR-34a、miR-221和miR-222的上调及miR-137、miR-375、miR-126、miR-451a、miR-145和miR-99a的下调关系密切〔40〕。同样的，TGF-β途径激活与miR-146b、miR-29b和miR-23b的上调及miR-663、miR-7、、miR-144、miR-200(Zeb1靶向)和miR-30的下调密切相关〔40,41〕。除了miRNA，目前已经证实多种长链非编码RNA(lncRNAs)在甲状腺癌中失调并参与EMT过程，上调的lncRNAs包括：与TGF-β信号途径相关的ANRIL、MALAT1、SPRY4-IT1；与BRAFV600E或MAPK信号途径相关的BANCR、ENSG00000230498.1、ENSG00000273132.1、LOC1-00507661等；下调的lncRNAs包括：与BRAFV600E相关的ENSG00000235070.3、ENSG00000255020.1；与PI3K/AKT信号途径相关的LINC003121；与MAPK信号途径相关的NAMA；与TGF-β信号途径相关的MALAT1等〔42〕。异常DNA甲基化是主要的表观遗传改变之一，PTEN是一种终止PI3K/Akt通路的磷酸酶，在甲状腺癌中检测到PTEN启动子高度甲基化，同时降低FTC的分化程度〔43〕。研究发现，在PTC样本中E-钙黏蛋白基因CDH1启动子高甲基化，导致E-钙黏蛋白表达减少，促进EMT〔44〕。

综上，大量研究证实EMT参与甲状腺肿瘤发生、转移和耐药性。EMT涉及多种信号转导途径、转录因子、特异性蛋白等生物学改变。这些生物学变化同时涉及多种表观遗传学改变，包括miRNA、lncRNAs和基因甲基化等，而表观遗传学的的可逆性可能会为逆转EMT带来新的出路。深入且全面的阐明EMT过程，并研发EMT新的特异性靶向药物或实现表观遗传学调控，对提高甲状腺肿瘤患者的生存率及生活质量具有重要的意义。