高效液相色谱法测定西藏不同地区蜂蜜中甲基乙二醛含量*

王筱婵，王 璐，刘梦蝶，邓永聪，梁晓凤，彭文科，杜 琳

(成都师范学院化学与生命科学学院，功能分子结构优化与应用四川省高校重点实验室，四川 成都 611130)

近二十年来蜂蜜的抗菌性越来越为人们所熟知，人们越来越多的将蜂蜜运用于医药与生活中，蜂蜜的抑菌、杀菌作用近些年已近得到了国内外专家学者的广泛研究[1]。美国医院采用因子指数20以上的麦卢卡蜂蜜来治疗第一和第二等级的烧伤。

一些研究表明新西兰麦卢卡蜂蜜在去除过氧化氢后仍然具有较好的抗菌性。研究发现麦卢卡蜂蜜的抗菌活性并不依赖于其中的过氧化物，所以这种物质被称为非过氧化抗菌活性物质(non-peroxide antibacterial activity，NPA)后来一些报道发现甲基乙二醛(MGO)可能是麦卢卡蜂蜜NPA中的主要物质基础，并且发现麦卢卡蜂蜜中的甲基乙二醛含量与NPA的相关性高达0.98。人们称赞麦卢卡蜂蜜独特的抗菌性并开始研究麦卢卡蜂蜜，发现麦卢卡蜂蜜具有独特的抗菌因子甲基乙二醛[2]，其对大肠杆菌[2]、铜绿假单胞菌[3]等有较好的抑制作用，其强大的抗菌活性，具有独特的营养保健功效。

关于蜂蜜中甲基乙二醛含量的研究，国外的检测方法建立较早。Weigel等[4]最早报道甲基乙二醛能与邻苯二胺发生反应得到喹噁啉类化合物，在反相色谱上有较好的保留，且紫外吸收强。Oelschlaegel[5]和Mavric等[6]确立的甲基乙二醛检测方法都是在Weigel[7]的研究基础上进行了适当修改。后来Windsor等[8]则更进一步，采用了邻-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺盐酸盐(PFBHA)做衍生试剂，能够同时检测蜂蜜中的甲基乙二醛、羟甲基糠醛和二羟基丙酮。国内相关研究起步较晚徐丽等[9]用2,3-二氨基萘做衍生化试剂用高效液相色谱-串联质谱法测定了澳大利亚28个麦卢卡蜂蜜部分新西兰和澳洲百花蜜中甲基乙二醛含量。陈磊等[10]利用邻苯二胺做衍生试剂通过高效液相色谱法测定了新西兰麦卢卡蜂蜜和中国不同产地的油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜等16个样品中的甲基乙二醛含量。赵琼晖等[11]用乙酸钠提取蜂蜜中的甲基乙二醛后用2,4-二硝基苯肼做衍生化试剂，建立了超高效液相色谱检测蜂蜜中甲基乙二醛含量的方法。

国外Stephens[12]等报道，新西兰卡卢卡蜜、三叶草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中甲基乙二醛的含量均远低于麦卢卡蜂蜜。孙明辉等[13]报道柑橘蜜中甲基乙二醛的含量3.68～6.19 mg/kg，杂花蜜中甲基乙二醛的含量3.63～6.80 mg/kg。由此知道蜂蜜抗菌物质甲基乙二醛含量是具有一定的地域特殊性，西藏地区平均海拔4000米以上，条件特殊气候优良，有大量珍贵蜜源植物，所产蜂蜜品质极高，而国内外的研究极少涉及西藏地区蜂蜜，既然蜂蜜甲基乙二醛含量具有地域特殊性，而西藏地区又是天然的蜂场，消费者也多购买西藏蜂蜜，因此有必要开展西藏不同地区蜂蜜中甲基乙二醛含量的研究，有利于填充西藏蜂蜜研究的空白，还有利于发展民族特色产品，促进蜂蜜产地的经济发展。

1 实 验

1.1 材料与试剂

蜂蜜样品：实验所用原蜜来自西藏日喀则市江孜县(1～6)和西藏自治区山南市乃东区(7～10)，西藏地区商品蜜(11～12)全部来自于成都四十一度蜂业有限公司，非西藏地区商品蜜(14～19)按蜜源植物分类主要有荞麦蜜、洋槐蜜、紫云英蜜，分别来自江西汪氏蜜蜂园有限公司、湖北神农蜂语生物产业有限公司、蜜爱蜜生物科技有限公司、安徽徽清堂有限公司、北京颐寿园蜂产品有限公司。实验共18个蜂蜜样品。18个样品产地及取蜜时间和种类如表1所示。

表1 样品基本情况(1～10原蜜，11～19商品蜜)Table 1 Basic information of the samples (number 1～10 were raw honeys, number 11～19 were commercial honeys)

试剂：甲醇(CH3OH，色谱纯)；乙酸(CH3COOH，色谱纯)；邻苯二胺(C6H8N2，分析纯)，Maclin公司；甲基乙二醛醛标准品(C3H4O2，40%水溶液)，Maclin公司。

仪器与设备：高效液相色谱仪，紫外光检测器；Kromasil反相色谱柱C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)；FA2204N型电子天平，上海菁海仪器有限公司；SZ-93型双重蒸馏水机，上海银泽仪器有限公司；移液枪，大龙兴创实验仪器有限公司；滤膜(有机相0.22 μm，水相0.22 μm)，天津市津腾实验设备公司。

1.2 实验原理与方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取甲基乙二醛标准品1.00 g溶解并转移到100 mL容量瓶中用二次蒸馏水稀释并定容至刻度，得到4 g/L的标准储备液。

1.2.2 样品的前处理

衍生化试剂：称取邻苯二胺0.6 g溶解并转移至100 mL容量瓶中，用二次蒸馏水稀释定容至刻度，配制成6 g/L的邻苯二胺水溶液，用于衍生化反应。

标准储备液衍生化：将标准储备溶液逐级稀释为适当浓度的标准工作液。用浓度不同的标准工作液分别和衍生化试剂1:1混合摇匀，在室温条件下，避光衍生反应8 h以上。

衍生反应式如下：

样品衍生化：称取1.00蜂蜜溶于10 mL水中，取1 mL该蜂蜜水溶液与1 mL衍生化试剂混匀。在室温条件下，避光衍生反应9 h以上。

1.2.3 样品浓度测定

以标准甲基乙二醛衍生化产物的峰面积为纵坐标，以甲基乙二醛溶液浓度为横坐标，绘出标准工作曲线。以标准工作曲线对实验样品溶液浓度进行定量。

色谱条件：

色谱柱：Kromasil反相色谱柱C18；

流动相：甲醇(A)-0.1%乙酸水溶液(B)梯度洗脱；

0～5 min，30 % A；5～10 min，30%A～90%A；10～15 min，90% A；15～20 min，90%～30%A；

20～25 min，30% A；

流速：0.6 mL/min；

柱温：30 ℃；

检测波长：318 nm；

进样量：10 μL；

1.2.4 结果计算

蜂蜜中甲基乙二醛含量的计算，结果按下式计算：

式中：X——样品中甲基乙二醛含量，mg/kg

C1————样品中甲基乙二醛浓度，mg/L

C0————空白样品中甲基乙二醛浓度，mg/L

V————试样体积，L

m————样品质量，kg

f————稀释倍数

2 结果与讨论

2.1 西藏原蜜甲基乙二醛含量比较分析

实验选取西藏日喀则市江孜县六种原蜜，西藏山南市乃东区四种原蜜。总共十份原蜜，实验所得数据与处理数据如表2所示。

表2 西藏地区原蜜甲基乙二醛含量Table 2 Content of methylglyoxal in raw honey in Tibet

此表中最高值来自于10号原蜜原蜜含量达5.87 mg/kg，最低值来自于2号原蜜含量为2.46 mg/kg。日喀则市江孜县原蜜甲基乙二醛含量平均值为4.14 mg/kg，而山南市乃东区原蜜甲基乙二醛含量平均值较高为4.36 mg/kg，因此蜂蜜的甲基乙二醛含量可能与蜂蜜的产地有关。五月蜜含量达5.56 mg/kg，六七月蜜含量有所降低，因此蜂蜜的甲基乙二醛含量可能与蜂蜜的取蜜时间有关。

2.2 西藏商品蜜甲基乙二醛含量比较分析

对同一产地六、七月份商品蜜进行MGO含量的测定，数据如表3所示。

表3 西藏地区商品蜜甲基乙二醛含量Table 3 Content of methylglyoxal in commercial honey in Tibet

由表3可知，西藏地区六七月商品蜜中甲基乙二醛含量均高于6 mg/kg，7月高于6月，说明蜂蜜的甲基乙二醛含量与蜂蜜的取蜜时间有关，究其原因可能是不同月份蜜源植物可能有所不同因此影响蜂蜜中甲基乙二醛含量。六月蜂蜜的主要蜜源植物有，狼牙刺、藏怪柳、藏黄连等，七月蜜主要蜜源有野荞麦、野鸡儿、紫花苜蓿等，不同的蜜源植物使蜂蜜品质有所差异，甲基乙二醛含量也不同。这与国外Marceau and Yaylayan[14]的研究结论一致。

2.3 西藏原蜜与西藏商品蜜甲基乙二醛含量比较分析

将实验所得的10种西藏地区原蜜中甲基乙二醛含量计算平均值与2种西藏地区商品蜜中甲基乙二醛含量平均值进行分析。

表4 西藏地区原蜜与商品蜜甲基乙二醛含量对比Table 4 Comparison of methylgoxal contents between raw and commercial honey in Tibet

实验所测西藏地区原蜜中甲基乙二醛含量均低于6 mg/kg，最大值在山南市乃东区昌珠镇2号蜂蜜中含量达5.87 mg/kg，最小值在日喀则市江孜县年堆乡含量为2.46 mg/kg，10个西藏地区原蜜样品平均值为4.23 mg/kg，西藏地区商品蜜中甲基乙二醛含量均高于6 mg/kg，最大值在夜伴蜂声七月蜜中含量6.92 mg/kg，最小值在夜伴蜂声六月蜜中含量为6.04 mg/kg，2个西藏地区商品蜜样品平均值为6.48 mg/kg。西藏地区商品蜜中甲基乙二醛含量约比西藏地区原蜜中甲基乙二醛含量高2.25 mg/kg左右。

2.4 商品蜜甲基乙二醛含量比较分析

实验选取2种西藏商品蜜和6种非西藏地区商品蜜来自于六个不同公司，进行实验后按蜜源植物或取蜜时间进行分类计算平均值，所得实验数据如表5所示。

表5 商品蜜甲基乙二醛含量Table 5 Content of methylglyoxal in commercial honey

此表中14号荞麦与18号紫云英蜂蜜中甲基乙二醛比其他公司同类蜂蜜含量都高。6种非西藏地区商品蜜中，14号荞麦蜜中甲基乙二醛含量最高达31.20，15号洋槐蜜中甲基乙二醛含量最低为6.60 mg/kg，2种西藏商品蜜种，12号夜伴蜂声七月蜜甲基乙二醛含量最高为6.92 mg/kg，11号夜伴蜂声六月蜜最低为6.04 mg/kg。荞麦蜜类平均含量最高，百花蜜类平均含量最低。孙明辉等[13]报道柑橘蜜中甲基乙二醛的含量3.68～6.19 mg/kg，杂花蜜中甲基乙二醛的含量3.63～6.80 mg/kg，西藏蜂蜜与之相比，含量较高，说明蜂蜜中甲基乙二醛含量可能与蜜源植物种类有关，因为西藏蜂蜜不是单一蜜源蜂蜜，蜜源植物来自天然野花，种类较多。

Marceau and Yaylayan[14]的研究结论：蜂蜜中二羰基化合物水平(甲基乙二醛也是一种二羰基化合物)与蜜源植物有关且深色蜂蜜比浅色蜂蜜有更高的二羰基化合物水平。此实验所用荞麦蜜颜色最深平均含量最高。

3 结 论

本文运用高效液相色谱法测定并研究了共18个蜂蜜样品中甲基乙二醛含量。研究显示西藏日喀则市江孜县原蜜甲基乙二醛含量为4.14 mg/kg，山南市乃东区原蜜中甲基乙二醛含量为4.36 mg/kg。两种不同产地的西藏地区原蜜甲基乙二醛含量相差较小。同时按照时间来看，5月甲基乙二醛含量最高为5.56 mg/kg，其次为7月4.14 mg/kg，6月为3.96 mg/kg，表明蜂蜜中甲基乙二醛含量与蜂蜜的取蜜时间有关。

西藏地区原蜜与商品蜜的对比中发现，商品蜜中甲基乙二醛含量高于原蜜。

与非西藏地区商品蜜的对比而言，西藏地区商品蜜中甲基乙二醛含量低于非西藏地区商品蜜中甲基乙二醛含量，这可能与蜜源植物种类不同有关，西藏蜂蜜蜜源植物来自天然野花，种类较多，而非西藏蜂蜜多采用的是单一蜜源蜂蜜，其中以深色乔麦蜜含量最高。这也为西藏发展单一蜜源从而更好的优化蜂蜜品质提供了思路。