DNA分析技术在单基因遗传病产前诊断中的研究进展

刘 宁 王 超 王芳芳 刘 羽 张玉红 张 婷 田婷婷 刘梅梅

哈尔滨医科大学附属第二医院(150081)

单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病,因遵循孟德尔遗传规律，又称孟德尔遗传病。单基因遗传病主要临床表现为智力障碍、生长发育迟缓、器官发育异常等，此类遗传病病种多、危害重且无法根治，给社会及家庭造成了沉重的负担，故减少此类患儿的出生是预防和控制遗传病出生缺陷的关键。对于有单基因遗传病患儿出生史的家系，在先证者致病基因及突变类型明确的基础上，可通过产前诊断防止患儿的出生。产前诊断是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等方面进行检测诊断，为能否继续妊娠提供相应科学依据。产前诊断可分为胚胎植入前遗传学诊断和妊娠期产前诊断。基因检测是在DNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。基因检测是确诊单基因遗传病最准确、最可靠的诊断技术，主要包括DNA分析技术和其相关生化检测技术。目前已实现各种产前诊断方式与多种基因检测技术相结合,在妊娠期对胎儿单基因遗传病进行诊断[1-3]，本文综述单基因遗传病产前诊断相关DNA分析技术和其相关生化检测技术的研究进展，为临床单基因遗传病产前诊断的方案制定提供一定的思路。

1 单基因遗传病的产前诊断方式

单基因遗传病的产前诊断方式有胚胎植入前单基因遗传学检测(PGT-M)、介入性产前诊断和无创产前筛查(NIPT)。PGT-M是一种用于识别受单基因缺陷影响的胚胎诊断技术，通过了解胚胎目标基因的基因型，选择没有患病风险的胚胎进行移植，以避免子代发病。但是，PGT-M存在可供检测的遗传物质少和扩增偏差容易引起基因脱扣等相关问题[4-5]。目前，PGT-M已成功应用于临床单基因病的植入前检测[6-7]，但所有接受PGT-M技术的病例都应在妊娠期接受介入性产前诊断以明确患病可能[8]。目前较常用的介入性产前诊断按取材方式不同分为绒毛穿刺、羊水穿刺、脐血穿刺以及胎儿镜活检等。这些方法只能在妊娠的特定时间窗内使用并且有流产的风险，羊膜腔穿刺因流产率更低和成功率更高成为首选的方法[9]。相比介入性产前诊断，NIPT借助高通量测序技术对孕妇外周血浆中的胎儿游离DNA(cffDNA)测序，具有更高的效益成本和更低的正常胎儿丢失率，不仅可以筛查胎儿染色体非整倍体风险率[10-11]，还可以对多种单基因遗传病进行产前筛查检测[12-13]。但NIPT只是一项筛查技术，存在着一定假阳性率和假阴性率[14]，而由此筛查出来的阳性病例仍需要进行介入性产前诊断以明确胎儿是否患病。近年来，随着单细胞基因测序技术的发展，胎儿细胞的基因信息更加完整和准确，利用从母体(外周血或宫颈)分离出胎儿细胞进行单基因病诊断拥有巨大前景，如已有利用孕妇宫颈中分离滋养层细胞诊断出胎儿患有囊性纤维化或脊髓性肌萎缩症的研究[15-16]。相比cffDNA，其优势在于可提供的遗传信息更全面，可选择的检测手段更多，适用范围更广等。但是仍有很多问题需要解决，如母源污染、嵌合性问题、基因脱扣问题、分离富集技术等问题。目前，利用胎儿细胞进行产前诊断仍处于实验阶段，评估其是否能真正超越和取代目前的基于cffDNA的NIPT检测，成为诊断技术，仍需大量临床研究数据的积累。

2 单基因遗传病相关DNA分析技术

2.1 Sanger测序技术

1977年Sanger等[17]发明双脱氧链末端合成终止法即Sanger测序技术，其原理是利用一种DNA聚合酶延伸结合在待测DNA模板上的引物，直到掺入1种链终止核苷酸测序才终止。在过去的 30 年里，Sanger测序技术因测序读长、准确性高被广泛运用于科研和临床工作的基因检测中，特别适用于已明确致病基因的遗传性单基因疾病基因诊断和产前诊断[18]。Sanger测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点，对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。例如，临床上采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序TCOF1基因可以检出多达90%的与Treacher Collins综合征相关的突变。到目前为止，Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准，也是二代测序技术(NGS)基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段[19]。虽然Sanger测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外，Sanger测序离不开PCR扩增，需要放射性同位素标记，只能分析单个DNA片段，通量小，不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，无法满足大规模测序的要求；操作繁琐且自动化程度低，检测速度慢；成本相对较高。

2.2 二代测序技术

21世纪高通量测序技术的问世为NGS奠定了基础，测序技术步入一个新时代。主要包括全基因组重测序、全外显子组测序(WES)和目标区域测序。NGS的主要优势在于通量高、可定量、速度快、成本低和分辨率高等，聚合酶或连接酶直接体外合成和测序同时合成同时测序[20]，目前已经成功地应用于PGT-M、NIPT及介入性产前诊断领域[21-23]。但NGS仍存在诸多问题，比如仍无法摆脱PCR扩增前后读取序列较短造成后期生物信息学析困难以及前期文库构建过程复杂等。Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例还要依靠具有高通量测序能力的NGS。总体而言，NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。不同的测序技术在测序范围、数据分析量，以及测序费用和时间等方面又有很大差别，如果选择适合的方法，对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。

2.2.1SNP连锁分析2010 年，Lo等[24]利用二代测序平台对孕妇外周血游离DNA进行全基因组测序，通过同一染色体上相邻的SNP位点构建单体型，并进行定量分析，建立相对单体型分析(RHDO)的方法，通过纯合子第1胎确定与致病位点连锁的SNP，并分别确定父母双亲的单体型，对孕妇外周血测序结果中父亲和母亲的1个单体型内多个SNP位点的检测，对检测结果进行序贯概率比检验，推断胎儿可能的基因型，增加了检测结果的稳定性，使结果更可靠。2013年，Chen等[25]开发了一种借助核心家系体型连锁分析的单基因遗传病的无创检测方法。针对与致病位点连锁的 SNP设计探针进行靶向捕获，基于先证者的基因型构建父母亲的单体型，继而对孕妇的血浆游离DNA进行深度测序计算胎儿的可能基因型。此方法不受突变类型影响，不受复杂重复结构限制，准确性高，适用于包括杜氏肌营养不良、先天性肾上腺皮质增生、脊髓型肌萎缩、血友病B在内的多种单基因遗传病的无创产前检测[26-29]。SNP连锁分析中双亲单倍型的构建核心家系分析的方法仅适用于有先证者存在的家系，对于临床取样以及科学研究都增加了诸多的限制，也不适用于未知突变的检测。

2.2.2全外显子测序技术全外显子测序(WES)只对含有编码区的外显子进行测序，这些外显子涵盖 85%的单基因病致病位点,迄今为止，WES已成功发现了数百种遗传病的致病基因[30-32]。此外，研究发现产前诊断中 WES 比染色体微阵列分析(CMA)能多检测出8.5%的致病性遗传变异[33]。WES具有覆盖范围广、测序成本低及处理时间减少等优势；WES的局限性在于检测结构变化的能力有限，不能完全覆盖某些蛋白质编码区域和潜在的功能性非编码元素，不能可靠地检测所有类型的遗传变异，如拷贝数变化、低比例嵌合、非整倍性、结构性染色体重排或三核苷酸重复扩增等[34]。因此，不建议将WES作为常规产前诊断方法推广应用，还应该进行核型分析和(或)CMA。此外，产前WES的成本尚未正式评估，尽管测序本身的成本正在迅速下降，但解释其临床意义不明变异和偶然发现基因突变的伦理问题所需的时间和人力是巨大的。相信通过产前诊断临床医生、遗传学专家和其他相关领域专家的共同努力，WES会更好地服务于临床。

2.3 三代测序技术

2.3.1纳米孔测序技术纳米孔测序技术，是一种基于电信号测序的新型技术。其优势在于不需要扩增或修饰、长阅读长度、仪器简单、使用成本低、测序速度快，并能对RNA进行直接测序；缺点是不能重复测序、错误率高。研究表明，尽管误差率较高，但纳米孔测序的表现可能与单分子实时测序技术一样好[35]；单分子实时测序技术和纳米测序技术在新基因组组装方面表现相似[36]。相比单分子实时测序限制于技术本身，纳米孔读取长度只取决于测序DNA分子的长度。此外，纳米孔测序技术还可以对RNA序列直接测序[37]。目前在临床上诊断为单基因病的患者中有很多患者在全外显子测序上得到阴性结果，纳米测序技术则能发现未确诊或被误诊患者的基因变异情况[38]。此外，纳米测序技术加速了微生物和临床相关的新型病毒的鉴定[39-40]，提高及扩展了临床诊断效率。虽然目前纳米孔测序技术尚处于研究中，但有望在不久的将来人们能利用其以最快的速度得到人类基因组相关信息，并有望用于产前诊断领域。

2.3.2单分子实时测序技术近几年，以单分子测序为最大特点的单分子实时测序已登上测序技术舞台。相比Sanger测序和NGS，单分子实时测序过程无需PCR扩增，边合成边测序，具有测序时间更短、精确性更高、成本更低廉、灵活性更强和通量更高等优点。缺点为 酶的活性与稳定性差、单分子信号会变成噪音增加荧光背景、延展DNA同时难以避免二聚体结构等。单分子实时测序凭借读取序列超长的优势可进行更广泛的基因检测，能发现NGS不能发现的重复基因组和结构变异区域[41-42]。单分子实时测序实现了对包括模式生物在内的多个物种的基因组测序，从简单的原生物基因组到复杂的高等动植物基因组[43-44]，以及最受重视的人类基因组。利用单分子实时测序对疾病相关基因组区域进行研究，是精准医疗的一大研究方向，未来可能会成为一种标准的医学诊断工具。

3 单基因遗传病相关DNA分析的生化检测技术

3.1 数字PCR技术

数字PCR(dPCR)是一种对微量模板进行绝对定量分析的技术，与传统定量PCR相比具有更高的准确性和敏感性，可以凭借微量胎儿cffDNA检测单基因遗传病，有可能成为胎儿产前基因诊断的重要研究工具。目前ddPCR在单基因病产前诊断应用更为广泛。ddPCR是一种新型的、可对DNA或RNA进行绝对定量的检测技术，每个微滴作为一个独立的PCR反应，扩增后利用探针上的特异性荧光信号对每个微滴进行检测，最后根据泊松分布原理，计算出原始样本的浓度。Camunas-Soler等[45]应用ddPCR技术成功诊断出9例单基因遗传病，包括血友病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷症和囊性纤维化等。Gruber等[46]应用该技术检测4对神经纤维瘤NF1突变基因和4对囊性纤维化CFTR突变基因的夫妇，研究结果显示所有母体血浆样本中都正确地评估了父源性突变基因的情况。该技术也被用在血友病F8和F9基因突变[47]的无创产前诊断中。数字 PCR技术通过单分子扩增降低了背景DNA的影响，具有超高灵敏度，可用于低浓度DNA的检测。但作为一项新兴技术，ddPCR检测胎儿染色体异常及单基因病尚未建立成熟的方法，需要更多的病例进行验证。

3.2 环化单分子扩增和重测序技术

2015 年，Lv等[48]研发了环化单分子扩增和重测序技术(cSMART)，对4个威尔逊病家族的ATP7B基因突变进行了无创产前诊断(NIPD)并得出与介入性产前诊断相同的结果。cSMART是一种对血浆中游离DNA中低比例突变进行定性和绝对定量的新型检测技术。cSMART可以消除潜在的PCR扩增偏倚，精确量化原始血浆样本中突变等位基因的比例以保证检测灵敏度与准确性。cSMART不仅可用于评估胎儿染色体浓度等,还应用于无创产前诊断中胎儿单基因遗传病的检测及肿瘤靶向用药及疗效动态监测[49-51]。cSMART检测只需要了解亲代致病突变或相关单核苷酸多态性(SNPs)的情况，是一种有前途的基于实验室的单基因疾病的NIPD通用策略。但在一些疾病中，致病突变涉及大的缺失或三核苷酸的扩增，则会影响cSMART的准确性和灵敏度。这需要对与常见单基因疾病相关的一系列其他类型的致病突变和/或连锁SNPs进行进一步研究，以确定cSMART对单基因疾病NIPT的总体效用。

4 结语

在出生缺陷中，单基因遗传病占有重要的比重。遗传咨询和产前诊断能够最大程度地减少此类患儿的出生,同时能够对单基因病家庭提供有价值的生育指导。基因检测是确诊单基因病最准确、最可靠的诊断技术。对于单基因病，基因诊断特别是DNA测序技术被公认是确诊该类疾病最准确、最可靠的诊断技术和金标准，它可以在基因水平甚至在单个碱基发生改变的情况下作出明确诊断，还可以在全基因组水平查出任何碱基的改变。近十几年来，测序技术取得了前所未有的进步，在基础研究和临床检测中已日益显出广阔的应用前景。从测序技术的发展历程来看，它经历了从简单到复杂，从单一到全面和多功能，从时间长、成本高、通量低、手工操作到快速、廉价、高通量、自动化，从多细胞到单分子、用量多到用量少的过程。产前诊断技术联合应用不同特点的基因测序技术,有利于叠加检测效益,从而最大程度地减少单基因病患儿的出生。