代谢组学技术在变应性鼻炎研究中的应用

陈阵，何善财，徐青青，许元腾

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是特应性个体接触环境中变应原后，通过IgE介导的多种细胞因子及炎性介质参与的鼻腔黏膜慢性非感染性炎症。目前，AR发病机制的假说包括“卫生假说”、“老朋友假说”等[1]。尽管经过多年的研究，AR的确切病因仍未完全阐明。探索更好的AR诊断、治疗及疗效监测的潜在生物标志物成为目前的研究热点。研究者正不断努力应用一种新技术——代谢组学，去寻找有效生物标记物，用于AR诊断、监测和治疗。

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后一门新兴技术，旨在研究给定样本中大量代谢物的整体变化，然后进行深层数据挖掘和生物信息分析[2]。内源性和外源性因素的微小变化可以在代谢产物的水平上反映出来。因此，代谢组学研究有将遗传、环境和生理因素与特定的病理状态联系起来的巨大潜力。在过去的几十年里，代谢组学已经成为研究代谢过程、识别潜在生物标志物和解开各种疾病代谢通路的有力工具。生物样品制备和仪器技术的进步，使得对多种代谢物的高通量分析成为可能，激发了人们对AR代谢组学研究的极大兴趣。本文就AR代谢组学研究进展进行综述，并分析代谢组学这一新技术运用于AR诊断、监测及治疗的可行性。

1 代谢组学研究中主要分析平台

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)谱和质谱(mass spectrum,MS)是代谢组学使用的两种主要分析平台。核磁共振波谱具样品制备简单、分析时间短、信号稳健和绝对量化等优点[3]，然而其灵敏度低，无法测量低丰度的代谢物。尽管如此，最近的技术已经最小化了这些缺点，并提高了NMR技术的灵敏度和分辨率[4]。相比之下，MS分析法具有灵敏度高，特异性强等优点，被广泛地应用于代谢组分的检测。特别是色谱-质谱联用系统，包括液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS)和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)，是目前最流行的技术。但由于质谱只能对经过分离、离子化处理后的代谢组分进行定性和定量分析，有些代谢物在质谱仪中不能被离子化，因此无法检测出所有的代谢物。GC-MS主要用于分析挥发性和热稳定性代谢物。LC-MS检测物质没有偏向性，可以分析不稳定、难挥发和分子量大的代谢物，二者提供了相互补充的代谢信息[5]。非靶向分析和靶向分析是代谢组学研究的两种传统策略[6]。非靶向代谢组学具有最好的代谢物覆盖率，可以帮助我们发现新的目标分析物，但它对低丰度代谢物的重复性差，敏感性有限。靶向代谢组学因其高灵敏度和可靠的定量能力而被视为代谢物定量的金标准，但它涵盖代谢信息是有限且均为已知的。更多代谢组学方法的实施流程见图1。

图 1 代谢组学实施流程图Fig 1 Implementation flow chart of metabonomics

2 代谢组学研究在变应性鼻炎的应用

2.1 血液代谢组

AR患者代谢组学研究的生物学基质主要集中在血液，这可能与血液具有微创性、易获得无污染样本的特点有关。多项研究应用非靶向代谢组学技术分析AR患者血清表明，AR患者血液中的代谢物含量有明显改变，多种代谢通路发生紊乱。苟小军等[7]基于GC-MS技术对AR患者血液中的代谢物进行研究，并筛选出了9个与AR发病机制密切相关的代谢物，可能与能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等代谢异常有关。Ma等[8]应用LC-MS代谢组学方法广泛探索AR患者血清代谢物谱，发现10种与AR密切相关的血液代谢物，可能与卟啉与叶绿素代谢及嘌呤代谢有关。Zhou等[9]采用H1-NMR技术研究了37例花粉症患者在症状激发前后血液代谢物谱，发现与缓解期相比，花粉症患者在发作期有18种血液代谢物含量明显下降，只有1种代谢物显著升高，提示花粉症发作过程与能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢来有关。有研究表明脂肪酸通过激活促炎性核因子-κB途径加剧IL-6为主导的炎症反应[10]。杨艳等[11]在此基础上，应用靶向代谢组学技术研究AR患者血清游离脂肪酸谱，发现7个有显著差异的脂肪酸，为发现精细化诊断AR的潜在生物标志物做出一定贡献。梁薇等[12]开创性的将代谢组学技术应用于AR患者中医症型的研究，发现肺虚感寒证和肾阳亏虚证过敏性鼻炎患者血清的代谢共性和各自特征，在分子水平上解释了中医症型之间的区别。青蒿花粉皮下免疫治疗的疗效目前还没有可靠度的客观评价指标，Shi等[13]采用LC-MS和GC-MS代谢组学技术，对患者治疗前后血清样品进行代谢组学分析，发现在皮下免疫治疗1年后，治疗有效患者的L-酪氨酸代谢水平升高，而治疗无效患者的L-酪氨酸代谢水平降低，说明L-酪氨酸可能是AR患者皮下免疫治疗疗效评价的潜在生物标志物。

2.2 尿液代谢组

尿液样本易得性和无创性的特点使其成为临床分析生物标记物的理想来源。早在上个世纪60～70年代，已经有研究注意到花粉热患者尿中5羟色胺的代谢产物5-HIAA升高，表明根据尿液代谢物区分AR患者和非AR患者成为可能[14]。Adamko等[15]利用H1-NMR技术研究豚草过敏的AR患者激发前后尿液代谢物谱，成功区分出与AR严重程度关联密切的11种尿液代谢物,证明通过尿液代谢物来客观评价AR严重程度是一种可行的方法。

2.3 肠道菌群代谢组

肠道菌群代谢组可以提供有关宿主、饮食和肠道微生物之间相互作用的信息，为探索微生物群与宿主表型之间的联系提供了一条有前途的途径[16]。肠道菌群代谢组学已广泛应用于各种疾病的生物标志物识别，如肠易激综合征[17]和非酒精性脂肪肝[18]等。然而，这种方法用于过敏性疾病的研究还很少，特别是针对AR的研究。一项大型的前瞻性队列研究表明婴儿期肠道微生物群多样性的降低与学龄期患过敏性疾病的风险增加有关[19]，为此有理由相信AR患者肠道菌群代谢物也存在改变，并对AR发生发展产生影响。Chiu等[20]联合NMR代谢组学及16S rRNA基因测序技术检测儿童粪便，发现AR患儿的粪便Dorea菌、Dialister菌和组氨酸水平显著降低，而其差异代谢物与差异菌群无明显关联，在一定程度上为AR肠道菌群多组学研究提供借鉴。肠道菌群代谢组在其他过敏性疾病上研究的相对较多，特别是哮喘[21]和食物过敏[22]。目前研究较一致认为过敏性疾病患者的粪便短链脂肪酸减少，而短链脂肪酸是能调节宿主免疫系统功能，促进机体Th1/Th2免疫平衡的关键点之一。

3 变应性鼻炎动物模型代谢组学研究

动物模型可以严格把控实验条件，增强实验组间的可比性，使其在代谢组学研究中具有独特优势。虽然已有多种动物模型实验用于变应性鼻炎的研究，目前最广泛应用的是卵清蛋白致敏的AR动物模型[23]。通过超高效液相色谱-质谱联用法检测小鼠血清，王嫒等[24]经过PLS-DA法建模发现，实验组和对照组样本可以达到基本分离，证明代谢组学对小鼠AR模型的诊断具有一定可行性，为AR的早期诊断提供新的参考。中医鼻炎治疗在一定程度上有很好效果，但其具体生物学机制仍未阐明。姜茗宸等基于代谢组学技术研究消风宣窍汤对变应性鼻炎小鼠血液[25]、尿液[26]和脾脏[27]代谢物谱的影响，发现消风宣窍汤可逆转AR小鼠体内多种组织的多种代谢途径紊乱从而改善AR症状。Zhuang等[28]运用代谢组学技术研究炒制苍耳子中药提取液对小鼠变应性鼻炎模型血清代谢谱的影响，发现其主要通过甘油磷脂代谢和支链氨基酸代谢途径起到治疗作用，为一步揭示苍耳子对变应性鼻炎小鼠模型的治疗作用机制提供一个可行的策略。Chen等[29]应用LC-MS/MS研究黄芩苷可通过调节与花生四烯酸代谢、柠檬酸循环、组氨酸代谢、亚油酸代谢有关的代谢平衡来减轻或逆转AR小鼠症状。Zhang等[30]基于代谢组学技术研究生物活性成分京尼平甙(Geniposide，GP)对代谢生物标志物和代谢途径的分子机制，并证明了GP通过改善细胞生长和增殖、组织发育和自由基清除途径对小鼠实验性变应性鼻炎具有保护作用。Liang等[31]应用代谢组学联合16SrRNA基因测序技术研究麻黄附子泻心汤对卵清蛋白诱导的AR大鼠模型的治疗作用，发现麻黄附子泻心汤通过恢复AR大鼠肠道菌群的多样性及增加粪便和血清SCFA的含量从而改善AR小鼠症状。未来基于动物模型的代谢物学研究将为AR诊断及药物治疗机制探索创造更多机会与可能。

4 过敏原及药物成分代谢组学研究

代谢组学在AR方面的应用不仅仅局限于针对疾病或动物模型的研究，还涉及过敏原及治疗药物的分析研究。Gilles等[32]通过对花粉代谢组学分析，揭示腺苷是树突状细胞发起的辅助性T细胞反应中的主要调节因子， 也对Treg细胞的功能起到重要调节作用，这为由花粉引起的变应性鼻炎的免疫机制及诊治提供了研究依据。An等[33]采用阴离子交换液相色谱方法，鉴定了一种新型的屋尘螨变应原，将有助于屋尘螨过敏的诊断和治疗，特别是对屋尘螨主要变应原无反应的患者。

5 变应性鼻炎代谢组学优缺点及未来展望

代谢组学通过展示多种生物流体和组织中代谢物变化的总体“指纹”，提供了无数潜在的生物标记物和治疗靶点。依靠其高灵敏度和特异性，代谢组学今后势必成为各类小分子代谢物研究的首选方法。然而，代谢组学仍处于初级阶段，尤其是在AR方面。虽然代谢组学在过去的10年里取得了很大的进展，但是代谢产物的公共和商业数据库仍然是有限且不完整的。目前的代谢发现只是AR病因学整体图景的“冰山一角”。另一个重要的问题是个体的异质性，受试者在基因型、病史、疾病进展、生活方式和饮食等方面的差异很可能影响其代谢，从而掩盖疾病的直接影响。

优化实验方案的验证性研究将成为今后的研究方向。研究中发现的潜在生物标志物和代谢途径需要大规模人群进行验证。如上所述，在进一步细分的AR亚型中可能识别到特定的靶点。同时使用互补分析平台对多种生物流体(如呼出气和鼻腔灌洗液等)和组织(如鼻黏膜等)进行联合分析，可以深入揭示生物研究的整体情况。此外，越来越多的证据表明微生物群失调和微生物代谢水平的变化与AR的发病密切相关。在肠道中发现了一些参与过敏性疾病调节的代谢物，其浓度可由肠道菌群调节，进而影响免疫系统的功能。将代谢组学与其他技术(如基因组学、蛋白质组学和转录组学)相结合，将有助于更好地理解宿主-微生物的相互作用，并为AR的诊断和治疗提供新的思路。