长链非编码RNA CARLo 5在急性髓性白血病中表达水平分析

邹勇

摘要：目的：研究长链非编码RNA CARLo 5在急性髓性白血病中的表达水平。方法：使用qRT-PCR检测15例急性白血病和15例缺铁性贫血患者的长链非编码RNA CARLo 5的表达差异。结果：长链非编码RNA CARLo 5在急性髓性白血病与缺铁性贫血患者中的表达存在差异。对比缺铁性贫血对照组，长链非编码RNA CARLo 5在急性髓性白血病表达升高，有统计学意义。其中AML组的2-△CT值（x±S）为：0.3177±0.036，而对照组的2-△CT值（x±S）为：0.1041±0.0121 （ P<0.001）。 结论：长链非编码RNA CARLo 5在急性髓性白血病中呈过表达状态，可以作为急性髓性白血病的生物学标记。长链非编码RNA CARLo 5有可能成为治疗急性髓性白血病的药物靶点。

关键词：长链非编码RNA，生物学标记，急性髓性白血病。

【中图分类号】R733.7 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）02-010-02

急性髓性白血病（AML）是较常见的血液系统恶性疾病，目前，化疗仍然是白血病治疗中最重要和最基本的治疗方法和手段，但是由于缺乏标靶的选择性，在杀死肿瘤细胞时也会无选择性的损伤正常的造血组织和细胞，往往在治疗过程中产生比较大的副反应。能够仅杀伤白血病细胞而对正常细胞无伤害的精准治疗是我们梦想的治疗方式，这就需要我们能找到白血病分子和正常分子之间的差异，针对差异去设计精准治疗方案。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。这类RNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能，无人关注，被尘封了起来。lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[1-3]。而随着高通量测序技术、大规模 LncRNA、 cDNA 文库的建立 、基因芯片技术的高速发展，LncRNA被发现与生物进化、胚胎发育、物质代谢以及人类多种重大疾病关系密切，包括肿瘤发生、转移等关键问题[4-7]。目前，LncRNA已经成为了肿瘤研究的前沿和热点。

LncRNA CARLo 5（cancer-associated region long noncoding RNAs 5），是一种最近确认的长链非编码RNA，位于染色体8q24，被认为在细胞周期和肠道肿瘤发展中有重要作用。LncRNA CARLo 5在肿瘤中发生，发展中有重要的意义，但LncRNA CARLo 5具体的作用机制及下游靶分子的研究尚不清楚，而且在白血病可中尚未见有LncRNA CARLo 5相关的基础研究。

材料和方法

1.病例资料

收集 2016年 5 月-2018 年 5 月在福建医科大学附属漳州市医院血液科确诊 15 例初诊的 AML 患者为研究对象（ AML 组），同期选择性别与年龄相符，且符合缺铁性贫血（ iron- deficiency anemia，IDA） 國际标准的 IDA 患者15 例作为对照组（ Control） 。所有入组者所留取的标本均为骨髓，所有入选者均签署知情同意书。本研究经我院伦理委员会审核批准。

2.主要的试剂及仪器

RNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司; 总 RNA 逆转录试剂盒购自美国 Thermofisher公司;荧光定量PCR（qRT-PCR）SYBR-Green 试剂盒购自日本 Takara 公司; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ GAPDH） 和LncRNA CARLo 5 上下游引物购自上海生工生物工程股份有限公司，7500 荧光定量 PCR 仪：美国ABI 公司。

3.样本收集、RNA 提取及逆转录

应用 EDTA抗凝管收集对照组、 AML组患者骨髓液 2 ml，用红细胞裂解液裂解红细胞后1 500 R / min 离心 5min，弃上清液后加入 1 ml TRizol充分吹打细胞沉淀，移至 1.5 ml EP 管中，标记保存于 -80 ℃。通过经典吸附柱法，按照说明书所述，抽提留存的骨髓标本中的总 RNA，紫外分光光度计检测 RNA 浓度及纯度。采用美国 Thermofisher 公司的逆转录试剂盒按其说明书步骤配置反应体系，在普通PCR 仪提前设置好的反应条件下将 RNA 逆转录cDNA，-20℃ 保存。

4.引物设计与合成

在美国国立生物技术信息中心（ National Center for Biotechnology Information，NCBI） （ https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/） 查找 LncRNA CARLo 5、 GAPDH基因序列，由上海生工生物工程公司设计并合成正反向引物，引物序列见表 1。

5.qRT-PCR

按照 SYBR Green试剂盒说明书操作，以 cDNA 为模板，反应体系为 20 μl，加入反应试剂进行 qPCR 反应。反应体系包括： 模板 cDNA 2 μl、SYBR 10 μl、GAPDH 或者 LncRNA CARLo 5 的正反向引物各 0.8 μl、加无菌蒸馏水至总反应体积 20 μl。qPCR 反应条件： 95 ℃ 、30s 预变性; 之后 95 ℃ 变性 5 s、60 ℃ 延伸 30 s，共计完成 45 个循环。每个样品均设 2 个复孔PCR扩增结束后可获取扩增循环数（cycle threshold CT）值，以 GAPDH为内参基因，采用2-△CT法计算LncRNA CARLo 5在实验组和对照组中的表达。

6.统计学处理

采用 GraphPad Prism 6.01进行统计分析。采用 t 检验分析LncRNA CARLo 5表达量的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

LncRNA CARLo 5 在 AML 患者骨髓标本中的表达情况

qRT-PCR 法检测LncRNA CARLo 5 在 15 例初治 AML 患者和15 例IDA 患者中的表达。结果显示，LncRNA CARLo 5 在 AML 患者中的表达量较IDA（ Control） 患者明显升高，有统计学意义。其中AML组的2-△CT值（x±S）为：0.3177±0.036，而对照组的2-△CT值（x±S）为：0.1041±0.0121，差异有统计学意义（P<0.001），见图1。

讨论

急性髓性白血病占据成人急性白血病的大部分，且多发于中老年人，因出现不耐受常规化疗、无骨髓移植的情况，预后不佳，急待副作用较小的靶向治疗。

Lnc RNA是一类长度大于 200 nts的RNA，在真核細胞内被广泛被转录，曾被认为不具备生物学功能。但目前研究认为Lnc RNA具有非常重要的生物学功能，其虽然不翻译，但也可以和蛋白分子一样，作为调节分子参与调控细胞的增殖、周期、分化、凋亡等各种生物学过程，也参与肿瘤的发生、生长、浸润、转移及复发等各种病理过程。如LncRNA UCA1 通过调节CREB蛋白表达水平并激活 PI3K 信号通路参与膀胱癌细胞周期的调控，促进了肿瘤的生长，表明 lncRNA 与肿瘤异常信号通路有关[8] ;LncRNA CCAT1被c-myc基因激活促进了胃癌的增殖和迁移[9]，而LncRNA-HEIH通过抑制 EZH2 靶基因提高了EZH2 蛋白表达水平，促进肝癌细胞周期 G0/G1 期阻滞。越来越多的文章表明，相对正常组织，LncRNA在恶性肿瘤中有明显异常的表达，它可以作为很多肿瘤的分子标记。

LncRNA CARLo 5是一种最近确认的长链非编码RNA，位于染色体8q24，被认为在细胞周期和肠道肿瘤发展中有重要作用。原癌基因MYC增强子的rs6983267 allet能与LncRNA CARLo 5的启动子的激活调节区域结合并长期作用，从而影响LncRNA CARLo 5的表达，而增加肿瘤的易感性[10]。Luo J[11]认为LncRNA CARLo 5是一个小细胞肺癌的阳性预后因子，和其致瘤性相关。而在肝癌研究的回顾性研究中，LncRNA CARLo 5也被认为和疾病进展和预后相关[12]。而在血液肿瘤中LncRNA CARLo 5的研究罕见报道。本研究表明，LncRNA CARLo 5 在AML 高表达，下一步可扩大病例数验证上述结果，并研究LncRNA CARLo 5 的表达水平与 AML 患者总生存和预后的影响。同时在白血病细胞株中深入研究 LncRNA CARLo 5 在白血病中的作用及可能的机制。

参考文献

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福建醫科大学附属漳州市医院血液科 363000