丙泊酚通过下调Yes相关蛋白的表达抑制卵巢癌SKOV3细胞体外的增殖、迁移及侵袭

柏效治 谢小娟 原翔 刘怡文 孔金玉 孙蔚 李燕乐

1河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院开元院区麻醉科（河南洛阳471003）；2河南科技大学临床医学院，河南省肿瘤表观遗传重点实验室（河南洛阳471003）

癌症是全球第二大死亡原因，预计全球新发癌症病例的总发病人口将从2012年的1400 万增加到2035年的2400 万［1］。卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，大多数卵巢癌患者在疾病治疗中需接受手术和麻醉。丙泊酚作为一种最广泛使用的短效静脉麻醉药，其术中应用与肿瘤患者疾病转归的影响一直是麻醉科医师关注的热点问题之一。既往研究结果发现，在细胞水平，丙泊酚能够抑制肝癌、食管癌、肺癌等的肿瘤细胞恶性生物学行为［2-4］，但丙泊酚抗肿瘤作用的分子机制不尽相同。Yes 相关蛋白（yes⁃related protein，YAP）是近年发现的Hippo 信号通路下游一个关键的转录共激活因子，其在卵巢癌中的高表达与肿瘤恶性程度及不良预后密切相关。本研究通过观察丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响，并检测细胞YAP 的表达量变化，探讨丙泊酚对卵巢癌肿瘤恶性生物学的影响及其调控的分子机制，以期为卵巢癌手术中丙泊酚的使用和围术期镇静药物的选择提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂卵巢癌SKOV3 细胞（中国科学院上海细胞库），慢病毒包装试剂盒（GeneCopeia公司，美国），YAP抗兔单克隆抗体（Abcam公司，英国）等。

1.2 实验分组观察丙泊酚对SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力，将实验分为空白对照组（C 组），溶剂对照组（D 组），25 μmol/L 浓度的丙泊酚处理组（P25 组），50 μmol/L 浓度的丙泊酚处理组（P50组），100 μmol/L 浓度的丙泊酚处理组（P100组）；观察YAP 过表达后是否干预丙泊酚对SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，将实验分为SKOV3⁃GFP 组（对照组）、SKOV3⁃YAP 组（过表达组）、使用propofol⁃SKOV3⁃GFP 组（丙泊酚+对照组）和propofol⁃SKOV3⁃YAP 组（丙泊酚+过表达组），分组中的丙泊酚处理浓度为50 μmol/L。

1.3 细胞功能学实验

1.3.1 CCK⁃8 实验取对数生长期细胞，接种至96 孔板中（1 × 103个/每孔），使用不同浓度丙泊酚的完全培养基进行换液，计时为0 h；在不同时间加入10 μL CCK⁃8 试剂，孵育2 h，测出450 nm 时吸光度；实验重复3 次。

1.3.2 平板克隆实验取含有不同药物浓度的细胞悬液2 mL（750 个细胞/mL），接种于6 孔板中混匀，每组重复3 个样本；混匀细胞培养2 ～4 周；当出现肉眼可见的克隆时终止培养，洗涤，固定，染色，计数、拍照。

1.3.3 划痕实验标记6 孔板，制备细胞悬液（1×105个/mL）；使用不同药物浓度的完全培养基进行细胞换液，以此作为0 h，拍照，标记位置，继续培养24 h时，对标记处位置再次进行拍照；使用Image J 软件测量同一位置不同时间点的划痕面积。

1.3.4 Transwell侵袭实验Matrigel胶包被Transwell小室基底膜；将细胞悬液100 μL 加入Transwell 小室上室；小室下部加入550 μL 含10%血清的对应药物浓度的完全培养基；培养24 h 后，洗涤、固定、染色，将小室放置于倒置显微镜上，拍照；并计数穿过微孔膜的细胞数，每组细胞设置3 个复孔。

1.4 免疫荧光实验向培养皿中加入1×103个细胞，待完全贴壁，加入不同药物浓度的完全培养基，培养24 h；甲醛固定，BSA封闭1 h，4 ℃一抗过夜后；荧光二抗孵育1 h，核染色后，共聚焦显微镜下拍照。

1.5 Western blot 实验细胞生长至培养皿面积的80%～90%时，加入蛋白裂解液200 μL，刮下蛋白，BCA 蛋白定量。将样本加入10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，BSA 封闭1 h；4 ℃下一抗过夜，复温2 h；二抗孵育2 h；加入显影液，曝光显影，保存分析。

1.6 构建YAP 蛋白过表达的稳定转染SKOV3 细胞系使重组慢病毒质粒于293Ta 包装细胞中表达、包装成具有感染活性的慢病毒颗粒并分泌进入细胞的培养基中。提取有感染活性的慢病毒颗粒与目的细胞共同培养，荧光显微镜观察转染效果，Western blot 验证转染效率。

1.7 统计学方法使用SPSS 23.0 统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料使用均数±标准差表示；比较采用单因素方差分析和独立样本t检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力影响实验结果显示D组与C组相比，SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭能力差异均无统计学意义（P＞0.05）。CCK⁃8实验结果显示在24 h时间点，与C 组相比，P50、P100组对SKOV3 细胞的增殖能力有抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.001），在36、48、60 h 时间点，P25、P50、P100组对SKOV3 细胞的增殖能力影响与对应时间点的C 组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。划痕实验结果显示丙泊酚能抑制卵巢癌SKOV3 细胞的迁移能力，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。Transwell 侵袭实验结果显示丙泊酚能抑制卵巢癌SKOV3 细胞的侵袭能力，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。见图1、表1。

图1 CCK⁃8 实验检测丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞系增殖能力的影响Fig.1 CCK8 test to detect the effect of propofol on the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cell line

表1 平板克隆、划痕实验、Transwell 侵袭实验检测丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞系迁移能力的影响Tab.1 Colony forming assay、wound healing、Transwell invasion assay was used to detect the effect of propofol on migration ability of ovarian cancer SKOV3 cell line ±s

表1 平板克隆、划痕实验、Transwell 侵袭实验检测丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞系迁移能力的影响Tab.1 Colony forming assay、wound healing、Transwell invasion assay was used to detect the effect of propofol on migration ability of ovarian cancer SKOV3 cell line ±s

注：*表示与空白对照组相比P ＜0.05；△表示P50组、P100组与P25组相比差异有统计学意义；▲表示P100组与P50组相比差异有统计学意义

分组C 组D 组P25组P50组P100组铺板1 000 个细胞/孔的成瘤数211.000±8.718 205.000±10.392 176.333±11.624 128.000±13.229*△88.000±6.429*△▲划痕实验24 h后迁移面积（mm2）20.731±0.454 20.575±0.749 15.262±0.288*11.362±0.435*△8.788±0.428*△▲24 h 穿过微孔膜下层的细胞114.333±5.207 115.667±7.219 87.000±7.767*74.333±7.881*58.333±6.173*△

2.2 丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP 蛋白表达的影响细胞免疫荧光结果显示YAP 蛋白主要位于细胞核内，丙泊酚能够下调SKOV3 细胞中YAP 蛋白的表达，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001），随着丙泊酚浓度的增加，SKOV3 细胞核中YAP 蛋白的表达量逐渐减少（表2、图2）。Western blot 结果显示丙泊酚能够下调SKOV3 细胞中YAP 蛋白的表达，组间比较差异有统计学意义（P＜0.001），随着药物浓度的增加，丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP 蛋白表达的抑制作用增强（表3、图3）。

表2 细胞免疫荧光法检测丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP蛋白表达的影响Tab.2 The effect of propofol on the expression of Yap protein in SKOV3 cells was detected by immunofluorescence x±s

图2 细胞免疫荧光法检测丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP 蛋白表达的影响Fig.2 The effect of propofol on the expression of Yap protein in SKOV3 cells was detected by cell immunofluorescence method

表3 Western blot 检测丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP 蛋白表达的影响Tab.3 Western blot was used to detect the effect of propofol on Yap protein expression in SKOV3 cells x±s

2.3 建立卵巢癌SKOV3细胞YAP过表达的稳定转染细胞系构建的稳定转染细胞系分为SKOV3⁃GFP 荧光对照组和SKOV3⁃YAP 过表达组，使用共聚焦显微镜观察两组细胞的转染效率，Western⁃blot 结果显示YAP 过表达后的SKOV3 细胞中YAP蛋白表达量明显增加，且与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图4。

图3 Western blot 检测丙泊酚对SKOV3 细胞中YAP 蛋白表达的影响Fig.3 Western blot was used to detect the effect of propofol on Yap protein expression in SKOV3 cells

2.4 YAP 过表达干预丙泊酚对SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响将实验分为SKOV3⁃GFP组（对照组）、SKOV3⁃YAP 组（过表达组）、propofol⁃SKOV3⁃GFP组（丙泊酚+对照组）和propofol⁃SKOV3⁃YAP 组（丙泊酚+过表达组）。CCK⁃8、平板克隆、划痕实验、Transwell 侵袭实验结果显示SKOV3⁃YAP组与SKOV3⁃GFP 组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；SKOV3⁃YAP 组与propofol⁃SKOV3⁃YAP组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；propofol⁃SKOV3⁃GFP 组与propofol⁃SKOV3⁃YAP 组之间差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。提示YAP 过表达后，SKOV3 细胞的增殖、迁移及侵袭能力均增强，YAP 过表达后干预丙泊酚对SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

图4 建立YAP 过表达的SKOV3 细胞稳定转染细胞系Fig.4 The stable transfection cell line of SKOV3 cells overexpressing Yap was established

表4 Western blot 检测SKOV3 细胞系中YAP 过表达效率Tab.4 The overexpression efficiency of Yap in SKOV3 cell line was detected by Western blot ±s

表4 Western blot 检测SKOV3 细胞系中YAP 过表达效率Tab.4 The overexpression efficiency of Yap in SKOV3 cell line was detected by Western blot ±s

注：*表示与对照组相比P ＜0.05

组别SKOV3 YAP⁃SKOV3 YAP 灰度值/GAPDH 灰度值0.723±0.068 1.130±0.112*t 值5.355 P 值0.006

3 讨论

麻醉药物和麻醉方法等因素可能引起围术期肿瘤微环境的改变，导致术后肿瘤的复发、转移［5-6］。目前，手术仍是卵巢癌的重要治疗手段，围术期管理对降低术后肿瘤复发转移的影响一直是麻醉科医生关注的重点。丙泊酚可能通过调控MAPK、NF⁃ΚB、HIF⁃α等信号通路的激活状态影响肿瘤的发生发展，但不同肿瘤细胞中调控恶性生物学行为的主要信号通路不同，导致丙泊酚对不同类型的肿瘤细胞可能产生不同的影响［7-8］。回顾既往研究，丙泊酚对卵巢癌细胞的恶性生物学行为的影响作用仍不明确。观察丙泊酚对卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响，进一步探讨其潜在机制，能够为丙泊酚应用于卵巢癌手术患者提供依据，为临床医生通过麻醉药物改善肿瘤患者预后提供新的思路，同时也为肿瘤患者个体化、精细化麻醉管理的发展提供证据支持。

图5 YAP 过表达干预丙泊酚对SKOV3 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响Fig.5 Yap overexpression interferes with the effect of propofol on proliferation，migration and invasion of SKOV3 cells

通过CCK⁃8实验发现，丙泊酚抑制SKOV3细胞的增殖能力，且随着丙泊酚浓度的增加，其抑制作用也越明显；通过划痕实验和Transwell 侵袭实验结果发现，丙泊酚对卵巢癌SKOV3 细胞的体外迁移和侵袭能力有抑制作用，且随着丙泊酚浓度的增加，其抑制作用也越明显。该结果与HUANG等［9］关于丙泊酚对卵巢癌ES2 细胞系中的研究结果相似，由此推断丙泊酚可能对卵巢癌的多个不同细胞系都存在潜在的抑制作用。

由YAP 的基因突变或表达异常引起的Hippo⁃YAP 通路的调控失常可导致细胞增殖/凋亡失衡和肿瘤形成［10］。在非小细胞肺癌中，YAP可通过调控lncRNA MALAT1 的表达促进肿瘤的增殖和迁移［11］；刘虹等［13］通过稳定转染的方法，下调大肠癌细胞株YAP 表达后，癌细胞的增殖和侵袭能力被明显抑制；miR⁃877⁃5p 可以通过靶向YAP1 抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭［13］。近年来，有研究发现Hippo⁃YAP 通路在卵巢癌等恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用［14-15］。LI 等［16］研究认为，丙泊酚能够通过调控YAP 信号通路保护海马神经元缺血再灌注损伤。本研究免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验结果显示丙泊酚成浓度依赖性下调了卵巢癌SKOV3 中YAP 蛋白的表达量。当使用丙泊酚处理后，过表达YAP 的SKOV3 细胞的增殖、迁移及侵袭能力仍能被丙泊酚抑制。因此，丙泊酚对SKOV3 细胞的生物学活性影响与YAP密切相关。由此推测丙泊酚可能通过下调YAP 蛋白的表达进而影响Hippo 通路下游的转录因子CTGF、survivin 等抑制肿瘤增殖、转移及侵袭能力，另外丙泊酚也可影响与Hippo 信号通路有交互作用的其他信号通路，进而影响肿瘤的恶性生物学行为，具体机制仍需进一步实验证实。

综上所述，丙泊酚对SKVO3 细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力有抑制作用，其机制可能与通过下调Hippo 信号通路中YAP 蛋白的表达有关。鉴于丙泊酚在体外实验中对于卵巢癌细胞的作用，可以为卵巢癌患者手术中镇静药物的选择提供参考。