低剂量吲哚美辛联合GANT-61通过调控软骨细胞焦亡减轻骨关节炎软骨损伤

扈佃磊(通讯作者) 荆玉峰 王钧芹 王明法 王正丽 刘天宇

( 山东省莒县人民医院 ， 山东 莒县 276500 )

骨关节炎(osteoarthrosis，OA)是一种慢性退行性疾病，其主要临床病症为软骨损伤[1]。当前OA治疗方法以药物治疗为主，吲哚美辛为治疗OA的常用药物之一，但其会对人体造成一定副作用，GANT-61为Hedgehog/GLI抑制剂，有缓解软骨损伤的作用[2]。本研究将讨论低剂量吲哚美辛联合GANT-61通过调控软骨细胞焦亡减轻骨关节炎软骨损伤的效果，具体报告如下。

资料与方法

1 实验动物分组及模型建立：健康昆明种小鼠30只，体质量30g-40g，购自中国医科大学动物部。通过横断前交叉韧带取得小鼠关节炎模型，对小鼠腹腔注射乙酰丙嗪1.25mg/kg+氯胺酮38mg/kg进行麻醉，麻醉成功后，切开小鼠的右后肢膝关节，将髌骨脱位，屈曲小鼠右后肢膝关节，横断前交叉韧带，使用盐水冲洗消毒，并缝合皮肤。将小鼠随机分为5组：吲哚美辛组、吲哚美辛联合GANT-61组、GANT-61组、对照组与正常组，每组6只。吲哚美辛组：将关节炎小鼠用吲哚美辛0.1mg/kg灌胃，每天1次，疗程3周。GANT-61组：将GANT-61按5mg/kg溶解于0.2ml二甲基亚砜(DMSO)中，注射于关节炎小鼠腹腔中，每天1次，共3周。吲哚美辛+GANT-61组：关节炎小鼠用吲哚美辛0.1mg/kg灌胃+腹腔注射GANT-61(5mg/kg溶解于二甲基亚砜)0.2ml，每天1次，共21天。对照组：关节炎小鼠生理盐水0.1mg/kg灌胃+腹腔注射二甲基亚砜0.2ml，每天1次，共21天。正常组：正常无关节炎小鼠。每周对小鼠进行关节炎评分。7周后将小鼠右后肢膝关节取下来进行组织学研究。

2 平均关节炎指数(MAI)测定：采用关节炎评分法(0-4级)：0级为无关节炎；1级为关节有轻微肿胀；2级为关节有中度肿胀；3级为关节重度肿胀；4级为关节严重红肿且难以负重。

3 软骨组织HE染色：于治疗后7周将各组实验动物处死，将其膝关节上下阶段并移至超净台，在剔除掉多余肌肉组织之后打开实验动物的关节腔，将其缺损处暴露在外，使用PBS缓冲液进行冲洗，随后将其放置于4%多聚甲醛之中，于避光条件之下固定24小时，完成之后使用清水冲洗24小时，使用常规石蜡进行包埋和切片，在HE染色后于镜下观察拍片。

4 多聚酶链式反应(PCR)法测定IGF-1基因表达：使用氯仿法提取实验动物瘢痕组织DNA，使用紫外吸收法测定其纯度及浓度。首先取200mg瘢痕组织放置于EP管中，使用眼科剪刀剪碎后加入1mlTrizol后震荡30秒，随后加入0.2ml氯仿，并震动30秒。舍弃试管内上层清液，将剩余溶液移入另一支无菌EP管之中，加入相同体积量的异丙醇溶液，放置于-20℃环境中30分钟，随后丢弃上层清液，加入1ml75%乙醇，于震荡后沉淀，洗涤2次。最后丢弃上层清液，使用滤纸吸收残留液体获取并于常温下干燥10分钟，干燥后将沉淀物溶于20μlDEPC水之中，待检验和计算纯度后于-80℃下进行保存，用于PCR检测之中。

6 结果

6.1 吲哚美辛联合GANT-61对血清炎症因子影响：吲哚美辛联合GANT-61的血清炎症因子减少明显(P<0.05)。详见表1。

表1 吲哚美辛联合GANT-61对血清炎症因子的影响

6.2 吲哚美辛联合GANT-61对关节炎软骨损伤影响：正常组的关节结构并未出现异常变化。对照组随着时间的不断延长，逐渐出现重度红肿现象，并伴随着食欲降低等症状。相比于对照组，吲哚美辛组、GANT-61组、吲哚美辛+GANT-61组的关节炎症反应均有所消退。详见图1。

图1 各组对关节炎软骨损伤的影响

讨 论

软骨细胞的存活是维持软骨关节健康的关节所在，成人软骨组织并未含有血管与神经，因此在软骨组织受损以后，其自行修补的能力极为有限[3]。软骨损伤通常因软骨细胞死亡所引起，这也是OA的主要临床特征之一，因此，如何抑制软骨细胞损伤，是治疗OA的关键所在[4]。有临床研究证明，软骨细胞退行性变与骨性关节炎软骨损伤和血清炎症因子有关[5]。焦亡是一种程序性细胞死亡，其表现为细胞持续膨胀直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放，激活强烈炎症反应。有临床研究证明细胞焦亡与骨关节炎软骨损伤有一定联系，可通过调控细胞焦亡对骨关节炎软骨损伤进行抑制[6]。

吲哚美辛属于环氧合酶-2抑制剂，具有镇痛与抗炎作用，但若大量使用，可能会引起较为严重的副作用。GANT-61则属于GLI抑制剂，具有下调GLI表达与调节不同细胞间平衡的作用。有临床研究于软骨细胞之中观察到GLI下调。在本研究中，使用吲哚美辛联合GANT-61后血清炎症因子减少明显(P<0.05)。吲哚美辛具有降低血清中炎症因子的作用，但低剂量吲哚美辛对于炎症的抑制作用有限，并不足以治疗OA，因此与GANT61联合使用，可有效降低血清中炎症因子。相比于对照组，吲哚美辛组、GANT-61组、吲哚美辛+GANT-61组的关节炎症反应均有所消退。低剂量吲哚美辛联合GANT-61对于缓解OA有着协同作用。

综上所述，低剂量吲哚美辛联合GANT-61具有协同抗炎作用，可通过对软骨细胞焦亡的调控，有效减轻OA症状。