“消癖煎”对乳腺增生模型大鼠的治疗作用及其机理研究

汪 怡 蒋洁君 李青松

（昆山市中医医院，江苏昆山215300）

乳腺增生好发于25～45岁女性，是育龄期妇女最常见的乳房良性疾病，其发病率占乳腺疾病的首位[1]。有文献报道，乳腺增生是乳腺癌发病的危险因素[2]。目前，对于乳腺增生的病因及发病机制尚不明确。现代医学认为本病的发生与卵巢内分泌失调关系密切，西医采用激素类药物缓解乳腺增生症状，但往往伴随着许多副作用和严重并发症，不适合长期治疗，外科手术也很难被多数人接受，且术后易复发[3]。中医药能有效治疗乳腺增生[4-6]，且毒副作用较小。消癖煎是昆山市中医医院院内中药制剂，具有活血祛瘀、疏肝理气之功效，多年来用于治疗乳腺增生具有良好的临床疗效。本实验制备大鼠乳腺增生模型，观察消癖煎对模型大鼠乳腺组织病理和血清性激素等的影响，探索消癖煎治疗乳腺增生的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级Wistar雌性未孕大鼠，体重180～200 g，由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2019-0001。

1.2 药品与试剂 消癖煎（昆山市中医医院制剂生产研发中心自制，按制剂处方取柴胡、赤芍、白芍、生山楂、橘叶、橘核、黄药子、路路通、紫苏梗、浙贝母、白芥子、夏枯草各10 g，当归、全瓜蒌、香附、牡丹皮各12 g，枳实、枳壳各8 g，生牡蛎、石见穿、生麦芽各15 g，青皮5 g，川芎、生甘草各6 g，加约8倍量水浸泡2 h后煎煮2 h，滤出药液后再加5倍量水煎煮1 h，合并2次药液，浓缩后加入适量95%乙醇至约60%醇浓度，充分搅拌，静置过夜，再滤出上清液，回收乙醇，加纯水制成含生药0.984 g/mL的浸提液，-4 ℃保存备用）。苯甲酸雌二醇注射液（杭州动物药品厂，批号180429），黄体酮注射液（浙江仙琚药业，批号180107），枸橼酸他莫昔芬片（扬子江药业，批号18122412）。血清雌二醇（E2）放免试剂盒、血清孕酮（P）放免试剂盒、血清垂体泌乳素（PRL）放免试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20190828）；苏木精、伊红（上海麦克林生化科技有限公司），其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 游标卡尺（上海汇一尺业有限公司），XH-6020型全自动放免计数仪（西安核仪 器 厂），2235型 轮 转 切 片 机（德 国Leica公 司），AUTOSTAINER XL全自动染色机（德国Leica公司），EC350-1冷热台包埋机（德国Microm公司），ASP300S全自动生物组织脱水机（德国Leica公司），TEC2500病理组织烘漂仪（常州郝思琳医用仪器公司），CX41生物显微镜（日本Olympus光学工业株式会社），DP72显微成像系统（日本Olympus光学工业株式会社）。

2 实验方法

2.1 造模 参考《乳腺增生动物模型制备规范（草案）》[7]制备乳腺增生大鼠模型。大鼠适应性饲养1周后，选取部分作为造模组进行造模，肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/（kg·d），连续25 d，随后肌肉注射黄体酮注射液4 mg/（kg·d），连续5 d。另选取部分大鼠作为空白对照组，同法肌肉注射等量生理盐水，连续30 d。各组分别取3只大鼠，光镜下对比乳腺组织结构及形态，确定造模成功。

2.2 分组与给药 将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、阳性药物组和消癖煎高、中、低剂量组，每组10只。阳性药物组按1.8 mg/（kg·d）给予枸橼酸他莫昔芬，消癖煎高、中、低剂量组给药剂量分别为2.65 g/（kg·d）、5.30 g/（kg·d）、10.60 g/（kg·d），另取空白对照组10只和模型对照组分别给予同体积生理盐水，各组均灌胃给药，1 次/d，连续30 d。

2.3 指标观察

2.3.1 乳头直径和高度 各组大鼠末次给药24 h后，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，水平仰卧位，将第二对乳头周围充分脱毛，擦拭干净，用游标卡尺精密测量第二对乳头的直径和高度。

2.3.2 血清激素水平 各组大鼠麻醉后，腹主动脉取血约5 mL，离心半径10 cm、3000 r/min高速冷冻离心15 min，取上层血清，放射免疫法测定E2、P和PRL含量。

2.3.3 乳腺组织病理形态 各组大鼠腹主动脉取血后处死，取下第二对完整的乳房，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片（4 μm），HE染色，光学显微镜下观察乳腺组织的结构及形态，对乳腺小叶、腺泡等计数，按文献[8]中的标准对乳腺增生情况进行评级，评级标准见表1。

2.4 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件-对数据进行分析，计量资料以（x± s）表示，各组数据均进行正态性检验，符合正态分布，组间比较采用独立样本t检验；等级资料采用非参数检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠乳头直径和高度比较 结果见表2。

3.2 各组大鼠血清E2、P、PRL水平比较 结果见表3。

3.3 各组大鼠乳腺组织病理形态比较 光镜下，空白对照组大鼠乳腺组织基本无增生现象。与空白对照组比较，模型对照组大鼠乳腺组织出现乳腺小叶体积增大，腺泡数量增多，腺泡和导管明显扩张，腺泡腔及导管内可见大量分泌物，腺泡上皮出现增生等明显的病理变化，乳腺增生病理分级趋向严重。与模型对照组比较，各给药组大鼠乳腺增生情况得到改善，腺泡数目减少，腺泡开始萎缩，腔内分泌物亦减少，乳腺增生病理分级亦有不同程度减轻。结果见图1、表4。

4 讨论

乳腺增生可归属于中医学“乳癖”范畴，始见于《中藏经》，龚居中《外科活人定本》首次将乳癖与乳房肿块联系在一起，并为乳癖设立了独立篇章，曰：“乳癖，此症生于正乳之上，乃厥阴、阳明之经所属也……何谓之癖，若硬而不痛，如顽核之类。”中医学认为乳腺增生是由于郁怒伤肝、思虑伤脾、气滞血瘀、痰凝成核所致，治以活血散瘀、疏肝理气[9]。消癖煎是我院乳腺外科专家经多年临床经验总结开发的中药复方院内制剂，方中柴胡、青皮、香附、全瓜蒌疏肝理气、调理冲任；川芎并合当归活血化瘀止痛；夏枯草、贝母化痰解郁；白芍、甘草酸甘化阴、柔肝平肝[10]。全方共奏疏肝理气、活血祛瘀之效，药证合拍。

表1 大鼠乳腺增生评级标准

表2 各组大鼠乳头直径和高度比较（±s）

表2 各组大鼠乳头直径和高度比较（±s）

注： 与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05；与阳性药物组比较，☆P＜0.05；与消癖煎高剂量组比较，△P＜0.05。

组别 动物数/只 乳头直径/mm 乳头高度/mm空白对照组 10 0.93±0.07 1.14±0.12模型对照组 10 1.40±0.25* 1.77±0.20*阳性药物组 10 1.07±0.13*# 1.31±0.16*#消癖煎低剂量组 10 1.33±0.20*☆△ 1.64±0.16*☆△消癖煎中剂量组 10 1.19±0.15*# 1.55±0.18*#☆△消癖煎高剂量组 10 1.11±0.14*# 1.30±0.24#

表3 各组大鼠血清中E2、P、PRL水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清中E2、P、PRL水平比较（±s）

注： 与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05；与阳性药物组比较，☆P＜0.05；与消癖煎高剂量组比较，△P＜0.05。

组别 动物数/只 E2/（pg/mL） P/（ng/mL） PRL/（μIU/mL）空白对照组 10 33.743±11.046 29.658±7.215 34.273±3.548模型对照组 10 79.332±9.752* 14.797±5.574* 48.505±5.110*阳性药物组 10 41.588±10.053# 26.069±8.257# 32.642±5.847#消癖煎低剂量组 10 60.883±9.189*#☆△ 19.638±7.012*△ 41.804±7.439*#☆△消癖煎中剂量组 10 45.510±11.031*#△ 24.199±10.705# 35.416±4.364#消癖煎高剂量组 10 37.649±8.911# 29.684±7.013# 33.823±5.071#

本实验采用苯甲酸雌二醇联合黄体酮制备乳腺增生大鼠模型，造模后大鼠乳头直径增大，高度增加，病理切片显示有明显的乳腺组织增生现象，血清E2、PRL水平升高，P水平降低，提示造模成功。乳腺直径和高度变化是乳腺的外观表现，乳腺组织病理形态学改变是乳腺的内在改变，乳腺的外观表现和内在改变是乳腺增生疾病临床表现的重要组成部分，可以了解疾病的发生发展及严重程度。本研究结果表明，消癖煎可以有效抑制乳腺增生模型大鼠乳头直径的增大和乳头高度的增加，以高剂量组效果最为明显，且与阳性药物治疗效果相当，病理切片进一步证实消癖煎可有效抑制乳腺组织增生，从动物实验角度证实消癖煎对乳腺增生的治疗作用。目前，国内外大部分研究表明体内雌、孕激素分泌紊乱是引发乳腺增生症的直接推动力：雌、孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全；催乳素升高，影响乳腺生长、发育和泌乳功能，同时影响下丘脑—垂体—性腺轴功能[9，11]。本研究结果提示消癖煎治疗乳腺增生的作用机制可能与调节体内激素水平有关。

下一步拟对乳腺组织雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达进行研究，从而进一步揭示消癖煎治疗乳腺增生的作用机制。

图1 各组大鼠乳腺组织病理形态（HE染色，×200）

表4 各组大鼠乳腺组织病理切片评级比较