深静脉血栓形成动物模型现状及展望

郭阗廷，张丽梅，王悬峰，石 锦，陈 曦，莫建文

（1. 赣南医学院2018级硕士研究生；2. 赣南医学院2017级硕士研究生；3. 赣南医学院第一附属医院骨科，江西 赣州 341000）

静脉血栓（Deep vein thrombosis，DVT）是多种因素引起的静脉血栓性疾病，是目前临床常见疾病并发症之一。该病发病率高，危害性大。肺栓塞（Pulmonary embolism，PE）是DVT 的主要并发症，是致残和死亡的主要原因之一［1］。DVT 和PE 一起被称为静脉血栓栓塞（Venous thromboembolic events，VTE），是常见的心血管疾病，发病率仅次于心肌梗死和脑卒中［2］。静脉血栓成因复杂，主要有遗传因素、创伤、血液粘度增大、长期固定、血管内皮功能异常等。遗传因素包括抗凝物质合成障碍，如抗凝血酶、蛋白C（Protein C，PC）或蛋白S 缺乏，或凝血酶原G20210A 突变。继发性危险因素包括高龄、使用激素、创伤、怀孕、大手术、长时间固定、癌症和抗磷脂抗体综合征［3］。DVT 治疗主要包括抗凝治疗和介入治疗等。目前血栓的发生发展的具体信号传导通路还不完全明确，研究血栓形成的信号传导通路、标志性的早期预警因子及预防、治疗的药物的研发都离不开动物模型。所以如何高效合理建立静脉血栓动物模型有助于深入探索深静脉血栓形成、发展、转归的病理过程和分子机制，并有助于研究早期预警、治疗方法和药物选择。

目前制备深静脉血栓动物模型的方法很多，主要是依据血流淤积、静脉内皮损伤和血液高凝状态进行制备DVT动物模型［4］。具体选用何种动物及制备方法需根据具体的实验要求和条件选择。理想的静脉动物模型应和人类发生血栓具有相似性，一般具有以下几个方面的特点：（1）实验动物和人类的基因相似性：不同种属的实验动物和人的基因相似性不同，与人类基因越相似的意义越大。因为涉及饲养成本和伦理问题能够供选择的实验动物有限，其中啮齿动物最常使用。（2）动物年龄：老年人相对于年轻人容易出现静脉血栓。所以老年的实验动物相对于幼年的实验动物更加有意义［5］。（3）血管情况和实验操作的方便：人类的静脉血栓往往发生在深静脉，所以实验动物的血栓最好也能在深静脉中产生并可以方便的进行取材和实验。（4）符合实验动物的3R原则［5］。（5）可重复性。（6）经济性。

1 造模动物的选择

目前较为成熟的DVT 模型选用的动物类型主要有以下几种：新西兰兔、比格犬、小型啮齿类动物（大鼠、小鼠）。不同的动物由于生理结构、生活习性、基因构成等不同而各具特点。例如DVT 在人体的发展过程可以分为急性、亚急性、慢性，但在实验动物如大鼠身上发生、发展就明显较人类迅速［5-6］。见图1。

图1 静脉血栓模型动物选择影响因素

1.1 小型啮齿类动物鼠类在实验动物中应用最为广泛。在DVT 动物模型中使用多为Wistar 大鼠、SD 大鼠、C57BL/6 小鼠等。其优势主要表现在：（1）标准“实验动物”的先天遗传性状、后天繁育条件、微生物携带状况、营养需求及环境因素等方面都受到全面控制，既能保证实验结果的可靠性、精确性、均一性、可重复和可比较性，又可保护接触和使用实验动物人员的健康；（2）遗传背景明确，模型性状显著且稳定，质量和规格可较随意选择；（3）品种多，基因多样性丰富，容易复制出各种相似于人类不同阶段、不同疾病条件下的模型［7］；（4）相应的检测试剂全面，且相对价格合理可接受。缺点：（1）个体较小，静脉小、静脉壁薄，在动物造模过程中对实验人员操作要求高［5］；（2）管腔小，如需进行超声介入等研究存在一定的困难。

1.2 新西兰兔在DVT 造模中也常使用新西兰兔作为实验动物。其优点是：（1）体型适中，性情温顺；（2）相对于鼠类，兔类的深静脉血管血量充足，压力较高，所以造模后血栓形成迅速，且容易形成充满整个血管的血栓；（3）兔类血管管径相对粗，方便进行超声、介入等研究。缺点：（1）兔类动物体型相对鼠类大，饲养成本高；（2）属于封闭群动物，缺少规范的近交系；（3）由于兔类喜活动，且早期栓子易脱落造成肺栓塞干扰实验进行；（4）兔类活动能力强不容易用固定的方法形成栓子。

1.3 比格犬犬类动物体型大，优、缺点明显。优点；（1）体型大，血管粗，便于操作，血栓形成快速可靠［8］；（2）手术耐受性好，较少死亡，可以进行慢性血栓形成及变化方面的研究［8］；（3）血管条件较好，可以应用介入等方式进行造模，较好的模拟人类血栓，且便于进行超声、手术、介入、溶栓等临床治疗研究［9］。缺点：（1）凶猛、肉食性、喜活动，所以饲养成本和难度较大；（2）研究用的试剂相对较少，成本高［9］。

1.4 其他大型动物如猪、灵长类动物等有较大的静脉多用于研究介入技术或超声多普勒对血栓的动态观察，但从种系角度看与人类不甚接近，且造价昂贵，人员占用多，术后管理困难，死亡率高等缺点，应用较为局限，目前较少应用。

2 造模血管选择

现有的DVT 动物模型在研究中使用模型动物的静脉广泛，常见的有下腔静脉、髂内静脉、股静脉、颈内静脉、颈外静脉等，肠系膜小静脉或提睾小静脉也有少量报道。现有报道中下腔静脉（Inferior vena cava，IVC）使用最为广泛。其具有手术操作方便，给药处理简单，造模方法较多，数据收集整理方便等优点［10］。

3 DVT的造模方法

健康的实验动物自身存在抗凝机制，自发形成DVT 的概率极低，目前DVT 造模方法均通过模拟DVT 形成主要原因：静脉壁损伤、血液高凝状态、血液流动缓慢。主要通过手术创伤、化学药物、电解固定等方法模拟其中一种或几种原因来实现。

3.1 下腔静脉结扎法下腔静脉结扎法原理为：通过手术对实验动物下腔静脉阻塞造成：（1）局部血管损伤，暴露血管内皮下组织因子；（2）局部造成低氧环境和炎症反应的发生，静脉内皮细胞变性，细胞浆内大量空泡形成，细胞水肿呈球形等因素；（3）损伤后炎症细胞浸润及各种细胞因子释放［11］。常用于鼠类和兔类实验动物。操作方法：实验动物麻醉后，沿腹白线切开进入腹腔，将小肠用一块湿纱布包裹保护后推置于动物右侧腹腔，显露下腔静脉及其主要属支，于左肾静脉下方结扎下腔静脉，后还纳肠管并关闭腹腔［10-11］。张惠明等［12］采用改良下腔静脉结扎法（简易悬吊术）制备动物模型，具有成活率高，造模成功率高，经病理检验符合人体静脉血栓形成急性期的病理变化，在下腔静脉结扎后2 h左右开始形成血栓。其适用于大部分品系鼠种，可以进行静脉壁与血栓之间关系的动态研究，为预防和治疗深静脉血栓提供生物力学参数，也用于研究药物体内抑制血栓形成的作用及机制。

3.2 下腔静脉狭窄法通过外力加压下腔静脉致血流减少，导致层状血栓形成，在保证血栓形成稳定性的同时，保持近心端通畅［10，13］。操作方法：实验动物麻醉后，取腹部正中切口并将小肠牵至腹外，不结扎周围分支。用外科神经血管钳在15 s内钳夹肾静脉以下的下腔静脉2 次，再用1 根5-0 缝线纵向置于下腔静脉腹面，另1根4-0丝线绕在下腔静脉和缝线周围，之后移除缝线，让血液流过［13］。另外一种改进法是：没有外力加压，但结扎侧分支，保持后侧分支开放，将1 根30 号的针头与下腔静脉用7-0缝线一并绑绕，再移除针头造成血管大约90%的狭窄［14］。该方法成栓原因为血管缩窄和内皮损伤，且移除针管后血管部分再通，所以，BFILL 等认为该法适用于研究深静脉血栓启动机制研究和动态分析溶栓药物机制［15］。BRANDT 等认为下腔静脉属支会影响实验过程中DVT 的形成，这使得血管解剖及血液流变学成为制备DVT 动物模型中的重要因素［16］。张智辉等增加对肾静脉段至髂静脉分叉水平的下腔静脉段分支结扎，明显提高DVT 形成的概率，更符合临床特点，改为缩窄下腔静脉+结扎肾静脉至髂静脉的下腔静脉各分支，联合利用血管阻断夹的方法，可建立稳定的大鼠DVT 模型［17］。运用狭窄法建立下腔静脉血栓模型，造模结束至造模后6 h是血栓形成的起始期，造模后6～48 h是血栓形成的稳定期，造模后3 d开始进入血栓消退期，至21 d 血栓完全消退，下腔静脉再通。因血管腔不完全栓塞更有利于观察血栓形成、溶解、再通全过程，因而研究血栓溶解和再通的实验中常选择该方法。

3.3 股静脉结扎法股静脉结扎法原理类似于下腔静脉结扎法，但死亡率相对较低，且方便研究深静脉血栓和肺栓塞之间联系。操作方法是采用微血管夹阻塞股静脉，通过阻断一侧股静脉的血流来形成DVT，也可以于通过不同时间点的栓子注入另一侧股静脉导致肺栓塞，来研究DVT 与肺动脉血栓和肺血管内皮细胞激活之间的关系［18］。季颖群等［19］采用单纯阻滞左股静脉血流加注入凝血酶的方法制备DVT 动物模型，观察大鼠肿胀发生率和股静脉血栓阳性率，认为此方式可以降低血栓自溶率，提高深静脉血栓、肺栓塞的建模成功率。该方法扰乱了内皮细胞的功能，产生各种血栓型组织因子（如炎症因子IL-6 等）［20］。此种方法提供了研究DVT与PE之间的关联关系的模型，且相较其他人工注入栓子形成PE的方法更加符合病理生理。

3.4 化学法（氯化铁法）氯化铁法通过影响血管的通透性导致血栓形成。文献报道的操作方法是：在实验动物麻醉后，在腹部做一正中切口显露下腔静脉，将周围组织与起自肾下静脉到髂腰静脉水平之间下腔静脉段分离，用1 块2 mm×4 mm 大小的滤纸在3.5%氯化铁溶液里浸泡，制备成氯化铁滤纸片。造模时将氯化铁滤纸覆盖在下腔静脉表面2～3 min［21］。另有文献报道：在颈内静脉或肠系膜静脉上覆盖经氯化铁溶液处理过的过滤纸也能形成微血管血栓［22］。这类化学法产生的模型所产生的血栓形成率高，但血栓较小且不能保证完全栓塞血管。化学法由于应用有毒药物，术后动物常死亡，无法观察长期变化。且由于药物作用不均一，血栓形成的情况重复性相对较差，故目前应用较少［22-23］。

3.5 电解下腔静脉法电解法的原理是直流电作用于血管，刺激内皮细胞产生反应。具体操作方法是：首先麻醉动物并显露下腔静脉及其属支，结扎下腔静脉周围部分属支。分别用1个针头，连接到1个镀银的铜线并插入皮下组织（阴极）和尾部的下腔静脉（阳极），施加250 μA 的直流电15 min，引起内皮细胞产生反应形成血栓锚，并认为造模2 d 后是急性DVT，14 d 后是慢性DVT。CULMER 等用该法来制备DVT动物模型来研究P选择素对于不同年龄段的小鼠之间的不同［24］。此法建模过程中血管温度稳定，血流影响小，类似于临床上的深静脉血栓形成条件，对局部组织刺激较小，适合研究血栓形成位置局部的细胞因子等变化。

3.6 促凝物质干预法促凝物质干预法就是通过增加局部血液中促凝因子，促进血栓形成。操作方法有：局部注射促凝剂或糖皮质激素等药物，导致实验动物血液高凝状态而产生DVT。此法能够减轻手术刺激模拟非手术、创伤等条件下出现深静脉血栓。苏畅等［25］用此法进行DVT 动物造模，采用自身对照研究，肌注3%戊巴比妥钠麻醉成功后将犬仰卧固定在操作台上，任选一侧股静脉区备皮，消毒、铺单，结扎股静脉的近、远端，并向腔内注入生理盐水5 mL稀释的凝血酶100 U。经彩色超声证实深静脉血栓的形成，并通过超声弹性成像能有效地反映不同时期血栓的弹性硬度，可以根据血栓的弹性硬度来初步判断血栓形成及分期［25］。笔者认为该模型较好模拟了临床因长期使用糖皮质激素及肿瘤等非外伤手术等因素造成的自发性深静脉血栓。

3.7 机械损伤法血管内皮损伤和血管、肌肉、骨骼等组织联合损伤都容易造成患者出现深静脉血栓。目前研究手术和创伤造成的深静脉血栓多用创伤模拟法进行造模。

3.7.1 人工造成静脉内皮的损伤法通过血管夹在静脉壁外直接钳夹造成对静脉内壁的损伤；或者用刮匙对静脉内壁造成损伤。有学者在阻断下腔静脉后，快速注入生理盐水，造成血管内皮细胞损伤，恢复血流25 min 后观察到血栓形成；或用蚊式钳在股静脉不同位置分别钳夹3 s，并用髋关节“人”字石膏固定的方法来制备DVT 动物模型［20］。该方法常用于研究深静脉血栓和炎症及炎症因子之间的关系。

3.7.2 机械击打装置法通过物理创伤可建立具有骨科临床特点的创伤性肢体DVT 动物模型，操作方法是用定量打击装置进行击打造成实验动物骨折或损伤组织并固定模拟临床上创伤—固定这一过程。具体方法是用一定能量击打造成的骨折，行髋关节“人”字石膏固定，7 d 后用肉眼和光镜观察DVT 形成。张英等借助专用击打装置击打髋部，并用石膏固定4 周，血栓形成率81.8%［26］。胡海澜等采用瞬间击打能量为5 J 能量的定量打击装置进行打击，髋部“人”字石膏固定的方式造模，其血栓发生率却只有51.7%［27］，该方法造模成功率差异较大，但较为符合临床实践中创伤引起的深静脉血栓形成原因。目前仍有大量学者使用该法进行抗凝药物机理研究和相关基因及信号传导通路研究［20，28］。

3.8 基因工程动物法

3.8.1 特定基因敲除动物某些基因出现突变，造成凝血功能增强是形成特发性血栓形成的潜在原因之一，如V 因子或G20210A 凝血酶原突变活化蛋白C（APC resistance，APC resistance）［29-30］。有学者通过基因技术产生具有类似凝血因子V突变的小鼠，模型动物有纤维蛋白沉积和血栓形成的倾向。这些基因敲除小鼠为进一步研究血栓形成提供了一个有效工具，可用以研究血栓形成机制和相关药物研发。

3.8.2 病毒转染干预基因动物模型CLEUREN等的综述分析了不同凝血因子［如血栓调节蛋白、蛋白C（PC）、组织因子（TF）通路抑制剂］或内皮细胞蛋白C受体突变的小鼠在静脉血栓形成研究中的潜在作用［31］。SAFDAR 开发了一个新动物模型，在该模型中，使用siRNA 抑制抗凝血酶和PC 的产生［32］，该模型中小鼠腿部、肝脏和头部血栓形成及纤维蛋白沉积和血液中纤维蛋白原水平下降［33］。病毒阻断凝血因子表达常用于来研究基于遗传的静脉血栓形成。

4 其他血栓模型

4.1 复发性静脉血栓形成模型发生过一次DVT发作的患者，经治疗后，仍有血栓复发的风险［34］。目前常用的深静脉血栓动物模型都集中在研究原发性血栓形成这个方向，关于DVT 复发机制的信息非常有限。2014 年，HARA 等［34］提出了一种复发性静脉血栓的造模方法。通过结扎颈静脉2天诱发原发性血栓形成，12 天内再次结扎血管。这一过程导致了两个明显不同的血栓形成，一个是旧血栓，小而有血管再通现象，另一个是新血栓，大而闭塞，富含纤维蛋白和中性粒细胞。该方法造模后实验动物的静脉壁出现类似于人类DVT 复发的典型征象。该模型反映了深静脉血栓复发患者的实际情况。另有研究采用两种模型联合模拟复发性DVT［35］，首次由电解下腔静脉诱导血栓形成，3 周后通过EIM或IVC结扎再次引发血栓形成。该模型常用于研究血栓形成后胶原蛋白、金属蛋白酶的变化。目前这两个模型是研究复发性深静脉血栓形成的主要手段。

4.2 肺栓塞模型肺栓塞是深静脉血栓最危险的并发症，一旦发生死亡率极高［1］。所以在临床上极为重视。目前学界认为肺栓塞是由于深静脉血栓脱落并随着血流运动到肺动脉造成肺动脉或其分支急性栓塞引起肺功能和右心功能障碍的临床综合征［36］。目前制作肺栓塞动物模型的方法主要有两种：（1）通过诱发形成深静脉血栓，再促使其进入循环系统造成栓塞。在该模型中，由氯化铁在股静脉中诱发血栓，并评估肺栓子的数量［37］。有研究认为肺栓塞和初始深静脉血栓的大小相关，通过进行研究栓子数目和栓子平均截面积来研究栓塞的程度［38］。（2）通过静脉注射栓子如自体取血制成血栓或注射外源性栓子如明胶海绵等，部分研究者会向实验动物体内注射促凝物质如氨甲环酸等［39］。促进血栓形成。常见的判断造模有效的方法为通过观察实验动物是否出现呼吸困难来初步判断。也有通过测定肺动脉契压［39］和处死后病理切片来进行研究。该模型可以用于不同的动物且成功率较高，也用于超声等影像学［40］和血清学研究［41］。

5 展 望

目前建立深静脉血栓模型，选择实验动物和建模方法众多，各有利弊，在实验设计时应根据具体实验目的和实验室条件进行选择。啮齿类动物成本低、品系多、研究透彻，但体型较小操作难度大，不适用于超声、介入等对血管内径有一定要求的实验。新西兰兔、比格犬、小香猪等大中型实验动物对手术耐受好、血管管径大、可耐受较复杂手术，可用于超声、介入等研究，但饲养成本高，管理困难。其他如恒河猴、狒狒等灵长类动物造模最符合人类疾病情况，但饲养成本巨大，伦理要求高。造模方法：下腔静脉结扎等方法成功率高，对血管影响大，并不能完全模拟临床实践中自然形成的深静脉血栓；促凝药物法可模拟高凝状态形成血栓；机械打击法最符合骨科创伤后血栓形成的临床过程，但是目前造模成功概率不稳定；化学法本身有毒性，且造模栓子较小，应用少。基因工程动物常见为啮齿类动物，作用靶点准确，说服性较好。近年来医学科学迅速发展，为了更好地研究和治疗静脉血栓性疾病，动物模型的应用越来越广泛，新的技术和方法层出不穷。但最基本的选择实验动物和造模方法原则依然是符合3R原则，且对实验最为有利。