基于UPLC法泽泻水提液指纹图谱的建立

2021-04-15 06:13黄王琛吕莹莹李改元唐文强
陕西农业科学 2021年1期
关键词:泽泻乙酰乙腈

罗 山,黄王琛,刘 懿,吕莹莹,李改元,唐文强,2

(1.陕西国际商贸学院 医药学院,陕西 咸阳 712046;2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心,陕西 咸阳 712046)

泽泻作为中药材,在我国具有非常悠久的历史,最早出现于《神农本草经》,是泽泻科植物泽泻(Alisma orientale (Sam.) Juzep.)的干燥块茎,具有利水渗湿、泄热化浊的功效[1~2],产地主要集中在四川、福建、江西和广西等地区。现代临床上主要用于降血脂、降血压、抗炎保肝、利尿、治疗糖尿病和抗肿瘤等[3~6]。

泽泻化学成分复杂,在临床上常作用于多个靶点,很难通过几个特定的成分对其质量进行整体评价[7]。指纹图谱是一种很好的“模糊鉴别”的方式,能够反映药材的整体特征[8~9]。张敏娜等[10]采用气相色谱(GC),通过控制程序升温的条件和方法学考察,建立了具有18个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。刘小蔓[11]等采用高效液相色谱法-电喷雾电离质谱技术(UPLC-ICP-MS),指认了泽泻6个特征峰。陈莹等[12]采用高效液相色谱法(HPLC),在208 nm和245 nm波长下,分别建立了含有17个和10个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。樊李明等[13]采用超高液相色谱法(UPLC),建立了含有14个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。在众多指纹图谱检测技术中,UPLC法能够对复杂体系实现快速检测,灵敏度高,可以节约分析时间,同时UPLC的检测温度低,不会对被检测物质造成破坏,能够最大限度的客观反应复杂体系的特征。此外,目前报道的关于泽泻指纹图谱的建立,检测的对象均为泽泻乙腈的提取液,但是在实际使用时,一般采用的是泽泻的水提液。不同的提取溶剂势必会造成泽泻提取成分的不同,指纹图谱也会存在差异,但是关于泽泻水提液指纹图谱的研究尚未见报道。因此笔者研究采用UPLC法,对来自四川、福建、广西、江西4个泽泻主要产地不同批号的20批泽泻水提液建立指纹图谱,并指认泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇醇B这三个泽泻的关键成分,为提高泽泻饮片质量控制方法提供实验依据

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与药材

采用美国waters公司生产的ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪;昆山舒美超声仪器生产的KQ2200DA型数控超声波清洗器;瑞士梅特勒公司生产的Mettler AE240电子分析天平;德国MAYZUN公司生产的TE124S电子分析天平;四川优普生产的UPT-I-10T反渗透超纯水机。

对照品:泽泻醇A(批号:R02N6F5398)、泽泻醇B(批号:M15A7S13161)购自上海源叶生物有限公司;23-乙酰泽泻醇B(批号:F0711AS),购自大连美仑生物有限公司。乙腈(色谱纯)购自美国天地公司;其它试剂均为分析纯,阿拉丁试剂(上海)有限公司;实验用水为UPT-I-10T反渗透超纯水机过滤所得。

20批泽泻样品产地分别四川、福建、广西、江西,均购自市售的各大药店,符合2015版《中国药典》标准,样品留存于陕西国际商贸学院中药研究院科研实验室201室。样品信息如下S1(190101)购自亳州市华云中药饮片有限公司(四川),S2(180401)、S3(180701)、S4(170101)、S5(170701)来自安国祁安药业有限公司(四川),S6(170701)来自四川省天府神龙中药饮片有限公司(四川),S7(20180801)购自陕西兴盛德药业有限责任公司(福建),S8(160908031)、S9(160800471)、S10(160904381)购自康美药业股份有限公司(福建),S11(171001)、S12(171003)、S13(171204)来自福建承天药业有限公司(福建),S14(180401)、S15(180404)、S16(180407)、S17(180409)购自广西,S18(P201605118)购自江西宏洁中药饮片有限公司(江西)、S19(1612011)购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司(江西)、S20(20170101)购自江西青春康康源中药饮片有限公司(江西)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取0.0037 g泽泻醇A,0.0035 g泽泻醇B和0.0024g乙酰泽泻醇B-23分别加入到5mL容量瓶中,加入适量甲醇完全溶解,然后用甲醇定容得单组分对照品溶液;精确量取上述各单组分溶液1 mL,加入到5 mL容量瓶中,用甲醇定容得混合对照品溶液。

1.2.2 泽泻水提液供试品制备 称取泽泻80 g,加水200 mL,浸泡30 min,先大火至沸腾,再小火煎煮2 h,纱布过滤,冷却,离心,取上清液即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm )色谱柱;流动相为乙腈( A) -水( B) ;梯度洗脱条件:0~4 min,5%~55%A;4~6 min,55%~70%A;6~10 min,70%~90%A;10~14 min,90%~5%A;14~15 min,5%~5%A;流 速 0.3 m L·min-1;柱温35 ℃;全波长扫描(190~400 nm) ;进样量 10 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

在190~400 nm范围内,采用3D通道,对泽泻水提液进行全波长扫描测试,结果表明208 nm为最佳测试波长,在208 nm下基线平稳,共有峰数量多,且分离度符合检测要求,部分峰具有较高响应值,因此选择208 nm作为泽泻水提液后续检测波长。泽泻主要化学成分为三萜类、二萜类、倍半萜类类等化合物[21~22],采用乙腈-水溶液作为流动相进行泽泻水提液的UPLC检测,基线平稳,色谱峰峰形好,各化合物之间分离度高。因此选择乙腈-水作为流动相,并采用梯度洗脱的方法对泽泻水提液进行分析。当柱温为35℃C时,泽泻水提液的UPLC谱图分离效果最好,因此确定柱温为35 ℃。

2.2 泽泻水提液指纹图谱的建立

2.2.1 精密度实验 精密吸取S1 批泽泻水提液供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件,连续进样 6 次,记录谱图。以14号峰泽泻醇B为参照峰,各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于 1% ,相对峰面积的RSD均小于4.88%,表明所用仪器精密度良好,符合指纹图谱的技术要求。

2.2.2 重复性实验 取S1批泽泻水提液供试品溶液6 份,按“1.2.3”项色谱条件依次进样,记录谱图。以14号峰泽泻醇B为参照峰,各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于 1%,相对峰面积的RSD均小于 4.45%,表明本方法重复性良好,符合指纹图谱的技术要求。

2.2.3 稳定性实验 取S1批泽泻水提液供试品溶液,按“1.2.3”项所述的色谱条件,分别在0,4,8,12,16,24 h 测定UPLC色谱图,以14号峰泽泻醇B为参照峰。结果显示,各特征共有峰相对保留时间的RSD 均小于 1% ,相对峰面积的RSD均小于 4.84%,表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。

2.2.4 专属性考察 按照“1.2.3”项所述的色谱条件进样溶剂甲醇,得溶剂甲醇的空白 UPLC 色谱图,结果见图1,由图1可见空白溶剂甲醇中没有明显的色谱峰,表明溶剂甲醇不会对泽泻水提液的色谱图产生干扰,所有的色谱峰均来自于泽泻水提液。

图1 空白溶剂甲醇的UPLC色谱

2.2.5 标准对照品UPLC色谱图的测定 按照1.2.3色谱条件分别进样泽泻醇A,泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B以及混合对照品溶液得对照品UPLC色谱图,结果见图2。

图2 对照品的UPLC色谱(1:泽泻醇A;2:泽泻醇B;3:23-乙酰泽泻醇B)

由图2可见,泽泻醇A的保留时间为8.892 min,泽泻醇B的保留时间为10.804 min,23-乙酰泽泻醇B的保留时间为11.956 min,三个对照品的分离度高,峰型好,无拖尾现象。

2.2.6 指纹图谱建立 按“1.2.2”项方法制备20 批泽泻水提液供试品溶液,采用1.2.3色谱条件进行测定,记录色谱图,经中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成指纹图谱,见图3。

(1)参照峰的选择。对比20 批供试品指纹图谱和标准品对照谱图,可确定14号峰为泽泻醇B,其峰与其它物质的分离度高,峰型好且稳定,故确定14号泽泻醇B色谱峰为参照峰。

(2)共有峰标定。由图3可见,经中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理,20批泽泻水提液共有19个共有峰(见图3 A),分别为1号峰(4.717 min),2号峰(5.642 min),3号峰(6.684 min),4号峰(7.0334 min),5号峰(7.239 min),6号峰(7.884 min),7号峰(8.254 min),8号峰(8.460),9号峰(8.665),10号峰(8.891),11号峰(9.241),12号峰(9.488),13号峰(10.441),14号峰(10.801),15号峰(11.951),16号峰(12.223),17号峰(12.6211),18号峰(12.2772),19号峰(13.7930),其中10号峰为泽泻醇A,14号峰为泽泻醇B,15号峰为23-乙酰泽泻醇B,这3个色谱峰的分离度高,分型好,而且稳定,能够作为泽泻水提液质量控制的指标性成分。

图3 泽泻水提液UPLC色谱(A)和20批泽泻水提液指纹图谱(B)

(3)相似度评价。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A 版软件计算分析,20批泽泻供试品色谱图中特征共有峰的相对保留时间的RSD 均小于1%,相对峰面积的 RSD均小于 5% ,色谱图相似度大于0.924(见表1),表明批次间存在差异,但差异性较小,制备工艺稳定,方法准确可靠。

表1 20批泽泻水提液与对照指纹图谱的相似度

3 结论

实验采用超高液相色谱法对20批泽泻水提液进行了分析,建立了泽泻水提液的指纹图谱,共标定了19个共有峰,同时指认了泽泻醇A,泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B三个泽泻主要化学成分的色谱峰,建议这3个成分为可作为泽泻水提液质量控制的指标性成分。不同产地不同批号泽泻水提液之间存在一定的差异,但差异性较小。该方法快速、准确,重复性高,稳定性好,特征性强,能够为提高泽泻水提液的质量控制提供参考。

猜你喜欢
泽泻乙酰乙腈
脲衍生物有机催化靛红与乙酰乙酸酯的不对称Aldol反应
泽泻到底“毒”不“毒”
高纯乙腈提纯精制工艺节能优化方案
乙酰半胱氨酸泡腾片对间质性肺疾病的治疗效果评价
乙腈在石墨烯极板表面的分子动力学模拟*
泽泻的炮制历史沿革研究
泽泻降脂食疗两方
头孢克肟残留溶剂的测定